Denne protokol beskriver en procedure, hvor menneskelige neuronal kulturer er transduceret med lentiviral konstruktioner kodning for mutant menneske Tau. Transduceret kulturer display Tau aggregater og tilknyttede patologier.
Aberrant aggregering af protein Tau er patetisk involveret i en række neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD). Selv om musemodeller af tauopati har givet en værdifuld ressource for at undersøge neurotoksiske mekanismer i aggregeret Tau, det bliver mere og mere klart, at på grund af interspecies forskelle i Neuro fysiologi, muse hjernen er uegnet til modellering af den menneskelige tilstand. Fremskridt i cellekultur metoder har gjort menneskelige neuronal kulturer tilgængelige for eksperimentel brug in vitro og har hjulpet i udviklingen af neurotherapeutics. Men på trods af tilpasningen af humane neuronal cellekulturer, in vitro modeller af human tauopati er endnu ikke bredt tilgængelige. Denne protokol beskriver en cellulær model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, at koden for patogenisk muteret Tau smeltet til en gul fluorescerende protein (YFP) reporter. Transduceret kulturer producerer Tau aggregater, der pletter positivt for thioflavin og display markører for neurotoksicitet, såsom nedsat axonal længde og øget lysosomale volumen. Denne procedure kan være en nyttig og omkostningseffektiv model for at studere menneskelige tauopathier.
Patologisk aggregering af den mikrotubule-associerede protein Tau er et definerende træk ved mange neurodegenerative sygdomme, herunder AD, frontotemporal demens (FTD), pick ‘s sygdom, og progressiv supranuclear parese (PSP)1. I en ikke-syg tilstand binder Tau sig til og stabiliserer mikrotubulære filamenter i neuronale axoner2. Men, sygdoms associeret hyperfosforylering af Tau fremmer Tau aggregering, afkobling fra microtubules, og neuronal toksicitet3. De toksiske virkninger af aggregeret Tau kan indebære afvigende aktivering af kolinerge4 og glutamatergic receptorer5 resulterer i dysregulering af intracellulære calcium og i sidste ende, celledød. I dyremodeller forbedrer reduktionen af hjernen Tau patologi i AD-mus6 og i musemodeller af repetitive mild traumatisk hjerneskade7.
Montering beviser viser, at strukturen og bindende affinitet af mus-afledte Tau adskiller sig fra menneske-afledte Tau og at musen Tau er uegnet til modellering menneskelige tauopathies8. Men, humane celle tauopati modeller er ikke almindeligt kommercielt tilgængelige. Det overordnede mål med dette arbejde er at beskrive en in vitro model af Tau aggregering, hvor menneskelige neuroner er transduceret med lentiviral-afledte vektorer, der indeholder mutant Human Tau konstruktioner9. Tau aggregat forårsager lentiviral konstruktioner koder for Tau gentage domæne husly P301L og V337M mutationer smeltet til en yfp reporter (Tau-rdlm-yfp) mens kontrol konstruerer kode for Wild-type (WT) Tau gentage domæne fusioneret til en yfp reporter (Tau-WT-yfp). Neuronal kulturer transduceret ved hjælp af denne metode udtrykke cirka ni gange mere Tau end ikke-transduceret kulturer. Selv om mængden af Tau udtryk over udtrykkes er nogenlunde lige mellem Tau-RDLM-YFP-og Tau-WT-YFP-transduceret celler, kun neuroner transduceret med Tau-RDLM-YFP display aggregater. Kulturer transduceret med Tau-RDLM-YFP bejdse positivt for thioflavin og display reduktioner i axonal længde og synaptisk tæthed. Derfor, denne cellulære model kan være et nyttigt redskab til at studere Tau aggregering in vitro.
Denne protokol beskriver dannelsen af en in vitro-model af human tauopati, der udviser sølv-bejdde-positive aggregater og thioflavin-positive neurofibrillære tangles (NFTS). Desuden, transducerede celler viser Tau-induceret patologier såsom morfologiske defekter, reduceret synaptogenesis, og en øget lysosomale volumen. Den største fordel ved denne protokol er, at det giver en tilgængelig og omkostningseffektiv model af neuronal tauopati, som kan bruges til Drug screening undersøgelser, samt til analyse af Tau toks…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Peter Davies på Albert Einstein College of Medicine for at levere PHF-1 og CP13 antistoffer og Dr. Marc Diamond på University of Texas, Southwestern, for at give Tau konstruktioner. Dette arbejde blev understøttet af tilskud fra Alzheimer’s Association (NIRG-14-322164) til S.H.Y. og fra California Institute for regenerative Medicine (TB1-01193) til P.R.
10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
Cell culture incubator | Various sources | NA | |
Centrifuge | Various sources | NA | |
DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
Human neural stem cells | Various sources | NA | |
Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
Water bath | Various sources | NA |