플라바놀에서 플라보놀의 생합성은 원팟 비엔자이매틱 캐스케이드를 확립하여
Summary
플라보놀의 유도는 의료 및 식품 산업에서의 응용에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 플라바논의 플라보놀의 생합성을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 그밖 접근에 비해 중요한 단계 및 그것의 이점에 토론합니다.
Abstract
플라보놀은 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가진 플라보노이드의 주요 하위 클래스입니다. 여기서, 우리는 플라보놀의 시험관 내 효소 합성을 위한 방법을 제공한다. 이 방법에서는 플라보놀의 생합성 경로에 있는 두 가지 주요 유전자인 Atf3h와 Atfls1이 대장균에서복제되고 과발화됩니다. 재조합 효소는 친화성 컬럼을 통해 정제되고 그 후 비엔자이매틱 캐스케이드가 특정 합성 완충제에 확립됩니다. 두 개의 플라보놀은 이 시스템에서 예로 합성되며 TLC 및 HPLC/LC/MS 분석에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다른 접근법에 비해 플라보놀의 유도에 명백한 이점을 표시합니다. 그것은 시간과 노동 을 절약하고 매우 비용 효율적입니다. 반응은 정확하게 제어하기 쉽고 따라서 대량 생산을 위해 확장됩니다. 대상 제품은 시스템의 간단한 구성 요소로 인해 쉽게 정제 될 수 있습니다. 그러나,이 시스템은 일반적으로 플라바네에서 플라보놀의 생산으로 제한됩니다.
Introduction
플라보놀은 식물 플라보노이드의 주요 하위 클래스이며 식물 개발 및색소 침착 1,2,3에관여합니다. 더 중요한 것은, 이 화합물은 항암제 4,5,산화6,항염증제 7, 항비만8,항고혈압 제 9와 같은 건강에 유익한 활동의 넓은 범위를 가지고 있습니다 , 및 메모리 리콜 속성10,이러한 식물 유래 보조 대사 산물에 대한 연구의 큰 숫자로 이어지는. 전통적으로, 이러한 화합물은 주로 유기 용매를 사용하여 식물 추출에서 파생됩니다. 그러나 식물11,12,13의함량이 매우 낮기 때문에 대부분의 플라보놀의 생산 비용은 여전히 높으며, 이는 의료 및 식품 분야에서의 적용에 큰 제한을 가합니다. 산업.
지난 수십 년 동안 과학자들은 플라보노이드14,15을파생하는 많은 방법을 개발했습니다. 그러나, 이러한 복잡한 분자의 화학적 합성은 다양한 본질적 단점을 가지고있다 16. 독성 시약 및 극단적인 반응 조건뿐만 아니라 표적 플라보노이드화합물(14,17)을생성하는 많은 단계도 필요하다. 더욱이, 이 전략에 있는 또 다른 중요한 도전은 액티브한 플라보노이드 분자의 키랄 종합입니다. 따라서 화학 합성16,17을통해 상업적 규모로 플라보노이드를 생산하는 것은 이상적인 전략이 아닙니다.
최근 과학자들은 플라보노이드 생합성 경로를 가진 미생물을 엔지니어링하여 이러한 복잡한 천연 화합물을 생산하는 유망한 대체 전략을 개발했습니다18,19,20, 21세 , 22,이는 성공적으로 식물23에서해독되었습니다. 예를 들어, Duan 등은 개화 효모 사카로미세세스 세레비시아에 생합성 경로를 도입하여 kaempferol(KMF)24를생산하였다. Malla et al. 아스트라갈린, 글리코실화 플라보놀,플라바노3-하이드록실라제(f3h),플라보놀 신타제(fls1), UDP-글루코골트랜스퍼라제:플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼랙타제 UGT78K1 유전자를 도입하여 대장균BL21 (DE3)17. 비록 꽤 많은 패러다임이 있지만, 모든 유전자 조작 미생물은 세포 플랫폼의 복잡성, 인위적으로 합성 된 유전 요소와 숙주 사이의 비호환성, 억제력으로 인해 관심있는 제품을 생산하지는 않습니다. 숙주 세포에 대한 표적 제품의 효과, 그리고 엔지니어링 된 세포 시스템 자체의 불안정성16.
플라보노이드 생산을 위한 또 다른 유망한 대안 전략은 시험관내에서 다중 효소 캐스케이드를 확립하는 것입니다. Cheng 외. 엔테로신 폴리케타이드는 하나의 냄비(25)에 완전한 효소 경로를 조립함으로써성공적으로 합성될 수 있다고 보고되었다. 이 무세포 합성 전략은 미생물 생산 공장의 제한을 우회하므로 일부 플라보노이드를 대량으로 생산할 수 있습니다16.
최근에는 나린게닌(NRN)을 한 냄비에 KMF로 변환하는 이효소합성 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 여기에서는 이 시스템을 자세히 설명하고 제품 분석과 관련된 방법을 설명합니다. 우리는 또한 NRN에서 KMF를 생산하기 위해이 시스템을 사용하는 두 가지 예를 제시하고 eriodictyol에서 케르세틴 (QRC)(ERD). 또한, 우리는 플라보노이드의 생합성에 있는 이 방법의 중요한 단계 및 미래 연구 방향을 토론합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 연구가 건강 관리 및 식품 산업에서 잠재적 인 응용 프로그램으로 인해 플라보놀의 유도에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 유기 용매와 화학 합성을 사용하여 기존의 식물 추출은 플라보놀의 생산에 사용을 제한 본질적인 단점을 가지고. 여기서, 우리는 시험관 내 비엔자이체 캐스케이드를 확립하여 한 냄비에 플라바놀로부터 플라보놀을 제조하는 상세한 방법을 보고한다. 이 프로토콜의 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 양주대학교 특별임명교수 창업기금, 장쑤특별교수 창업기금, 장쑤성 6대 인재피크 프로젝트(Grant No. 2014-SWYY-016) 및 기금 지원 사업으로 재정적으로 지원되었다. 강수 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발 (수의학). 우리는 HPLC및 플라보노이드의 MS 분석을 위한 양저우 대학의 시험 센터에 감사드립니다.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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