Perineural invasion är en aggressiv fenotyp för huvud och hals skivepitelcancer cell karcinom och andra tumörer. Den chick chorioallantoic membran modell har använts för att studera angiogenes, cancer invasion, och metastaser. Här visar vi hur denna modell kan användas för att bedöma perineural invasion in vivo.
Perineural invasion är en fenotyp där cancer omger eller invaderar nerverna. Det är förknippat med dålig klinisk effekt för huvud och hals skivepitelcancer och andra cancer former. Mekanistiska studier har visat att den molekyl ära överhörning mellan nerver och tumör celler sker före fysisk interaktion. Det finns bara ett fåtal in vivo modeller för att studera perineural invasion, särskilt för att undersöka tidig progression, innan fysiska nerv-tumör interaktioner uppstå. Den chick chorioallantoic membran modell har använts för att studera cancer invasion, eftersom källaren membranet i korionic epitel härmar den mänskliga epitelial vävnad. Här har vi återanvända chick chorioallantoic membran modell för att undersöka perineural invasion, ympning råtta dorsala roten ganglier och mänskliga huvud och hals Skivepitelcancer celler cell carcinoma på korionic epitel. Vi har visat hur denna modell kan vara användbar för att utvärdera cancer cellernas förmåga att invadera nervvävnad in vivo.
Perineural invasion (PNI) är en understuderad fenotyp i cancer, som är förknippad med hög sjukdoms upprepning och dålig överlevnad hos patienter med huvud och hals skivepitelcancer (HNC)1. PNI definieras mikroskopiskt som tumör celler inom eller kring nerverna2,3. När PNI upptäcks kommer patienterna sannolikt att få adjuvant behandling såsom elektiv hals dissektion och/eller strål behandling4,5. Emellertid, dessa terapier är aggressiva, och inte PNI-specifika. I själva verket, det finns ingen terapi för att blockera PNI, främst eftersom mekanismerna bakom nerv-tumör interaktioner är fortfarande dåligt förstådda.
Olika molekyl ära mekanismer har varit inblandade i nerv-tumör attraktion; tumörer och stromaceller celler frisättning neuropeptider och tillväxtfaktorer för att främja neuritogenesis6,7. När odlade tillsammans in vitro, HNC celler och dorsala root ganglier (DRG) båda har en robust respons; effekter på tumör cell invasion och neuritogenesis kan ses efter några dagar i kultur6,8,9. Emellertid, det finns en brist på lämpliga in vivo modeller för att upprepa tumör-nervinteraktioner före invasionen. Här presenterar vi en in vivo PNI modell för att studera tidiga interaktioner mellan HNC celler och nerver6. Vi anpassade chick chorioallantoic membran (CAM) modell för att inkludera en neural komponent, ympning en DRG i CAM, följt av ett transplantat av cancer celler för att efterlikna en innerveras tumör mikromiljö.
CAM-modellen har använts framgångs rikt för att bedöma invasionen av cellerna genom basal membranet, imitera tidiga invasiva stadier av karcinom och melanom10,11,12. CAM består av övre korionepitel, mellanliggande Mesenchyme, och lägre allantoiskt epitel. Den korionic epitel är strukturellt liknar humant epitel10,13 i att kollagen-IV-rika källaren membran simulerar källaren membranet som separerar det muntliga epitelet från den underliggande bindväv. Sedan den första tumören ympkvistar utfördes i cam i 191314, många anpassningar av metoden utvecklades för att möjliggöra bedömning av angiogenes15,16,17, tumör progression, och metastasering18. Viktigt är att tekniken för ympning tumörer på CAM har förändrats mycket lite, men ansökningarna utvecklas kontinuerligt. Analyser av ökande komplexitet har publicerats, bland annat drog screening19, benvävnads teknik20, och nanopartikelbaserade läkemedel mot cancer21.
Vårt laboratorium använder en CAM-DRG modell där ett däggdjur DRG isoleras och ympas på ytan av den övre CAM. När DRG införlivas i CAM, är HNC celler ympade nära DRG och får interagera med DRG innan hela in vivo-systemet skördas och analyseras. Viktigt, systemet tillåter ex-vivo visuell observation av både DRG och tumör genom fluorescens märkning av DRG och tumör celler. Detta protokoll omfattar flera steg med olika komplexitets nivåer som utförs inom 17 dagar, från inkuberande ägg till skörd av CAM (figur 1). Celler som uttrycker olika proteiner av intresse kan testas i denna modell för att belysa de molekyl ära vägar som ansvarar för nerv invasion i cancer, och även för screening av läkemedel för att direkt rikta neurala invasion. Celler förbehandlade med en läkemedels kandidat kan ympas på CAM och förekomsten av PNI undersökts i jämförelse med obehandlade kontroller. I själva verket, CAM-modellen har använts för drog screening som ett mellanliggande steg mellan in vitro-studier och pre-kliniska in vivo prövningar på gnagare19.
Den experimentella designen kommer att variera med hypotesen. Till exempel, om att testa rollen av ett specifikt protein på PNI, den experimentella gruppen skulle omfatta DRG ympas med tumör celler överuttrycker proteinet, medan kontroll gruppen bör omfatta DRG med celler stabilt transfekterade med Tom vektor. Flera olika experimentella utformningar kan användas för att hantera specifika frågor.
CAM-DRG in vivo-modellen som presenteras här behandlar underskott tidigare modeller genom att demonstrera nerv-tumör interaktion innan fysisk invasion av nerven av tumör celler. De flesta in vivo studier av PNI fokus på tumör spridning och hämning av motorisk funktion, och beror på direkt insprutning av tumör celler i ischiasnerven23,24,25. Den ischiasnerven injektion är en in vivo modell av PNI där cancer celler injiceras i en mus eller råtta ischiasnerven där tumören därefter växer. Injektion modeller är användbara för att Visa destruktiva tumör progression och smärta till följd av tumör celler i nerver. Ischiasnerven modellen är också lämplig för studiet av faktorer som gör att cancer celler att frodas i nerven men saknar förmåga att utvärdera den tidiga fasen av PNI, eftersom det introducerar celler direkt i nerven, förbi nerv slidor. I ett annat tillvägagångs sätt, kirurgiskt implanteras ortotopisk tumör transplantat användes för att karakterisera vikten av adrenerga och kolinerga nerv fibrer för att främja prostata cancer progression, vilket tyder på en framträdande roll av nerver i tumör progression 26. denna modell bestod av kemisk ablation av murina sympatiska och parasympatiska nerver. Den Parasympatiska fibrer infiltrerade tumör vävnader, en process i samband med PNI, men modellen var inte specifikt används för att bedöma fysiska interaktioner mellan nerv och tumör. CAM-DRG-modellen möjliggör utredning av interaktioner mellan nerv och cancer under PNI. Dessutom är murina modeller dyra och tids krävande jämfört med CAM-modellen. Vi föreslår att man använder CAM-DRG-modellen för mekanistiska studier av PNI.
Några fördelar med CAM-DRG tillvägagångs sätt inkluderar bedömning av PNI och andra fenotyper, såsom tumör tillväxt, metastaser, och angiogenes. Identifiering av mänskligt DNA på nedre CAM och/eller i levern kan användas för detektion av metastaser av mänskliga cancer cellinjer10, en känsligare experimentell metod jämfört med vävnad snittning och färgning, som inte kan avslöja små metastaser.
CAM-DRG-metoden har vissa begränsningar, inklusive den korta observations tids ramen. Embryots immun system är fysiologiskt aktivt vid dag 1827, då avstötning och en inflammatorisk process kan äga rum, vilket begränsar den experimentella tiden. Det är också viktigt att beakta avståndet vid ympning tumör celler nära DRG; större DRG-cancer avstånd kan försämra den molekyl ära interaktioner mellan tumör celler och nerv, eller kan fördröja den fysiska kontakten mellan båda komponenterna i modellen. Även om embryona är äldre än vad som föreskrivs i detta protokoll, embryorörelser kan tränga undan tumör cellerna. Därför är det viktigt att använda ägg i enlighet med dag 10 post-fertilisering för cell ympning.
Eftersom immun försvaret inte är fullt utvecklad före dag 1827, tumören mikromiljö i cam liknar den hos de immunsupprimerade murina modeller som ofta används för cancer studier. Därför är denna modell inte användbar för att bedöma immun cellernas roll i tumör progression. En annan begränsning är den begränsade till gången på reagenser för kyckling arter, såsom anti kroppar, cytokiner och primers.
Korrekt utförande av detta protokoll kräver övning; Det kan dock göras av en laboratorie medlem utan behov av en specialiserad Core anläggning. Borrning av äggskal kräver träning. Öva på livsmedels butiker (icke-befruktade) ägg rekommenderas innan du försöker denna modell för första gången. Hög embryonal överlevnad och framgång av modellen kan uppnås om vissa kritiska åtgärder för att undvika infektion följs: lämplig antibiotika profylax av DRGs i 2% penna/STREP, arbetar i ett laminärt flöde skåp, och undvika spridning av äggskal partiklar på ca-modulen. Det är också viktigt att hålla en stabil fuktighet under den totala ägg inkubations tiden. Vi rekommenderar att du ökar antalet ägg per grupp tills tekniken behärskar. De vanligaste problemen för oerfarna laboratorie personal är äggkontaminering och felaktig teknik för cell ympning.
DRG skörd kräver också utbildning; metoder för skörd av DRG för in vitro-experiment8 innan man försöker in vivo-modellen rekommenderas. DRG-kulturen in vitro är en möjlighet att optimera förhållanden och förbättra tekniken för att förkorta DRG-extraktionstiden. Särskild uppmärksamhet på skörd teknik krävs när greppa DRG med pincett. DRG bör inte hållas direkt. Tryck bör appliceras under den. Vi rekommenderar användning av förstorings glas för att bättre visualisera DRG under extraktion.
Viktigt, när du utför denna modell för första gången, alla villkor bör optimeras för önskad cellinjen. Denna modell var optimerad för råtta DRG och HNC cellinjen UM-SCC-1. Användning av mus DRG och andra cancer cell typer kan kräva optimering. Med en högre koncentration av ympade celler, tumörer tenderar att växa tjockare och styvare, vilket underlättar tumör mätningar. Med hänsyn till flera ägg för varje grupp och en lämplig koncentration av celler för varje ägg, kan flera miljoner celler krävas för varje experiment. För att under lätta planeringen bör man ta hänsyn till kunskapen om fördubblings tiden för cellerna. För vissa kritiska steg i det här protokollet finns en fel söknings tabell (tabell 1).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH/NIDCR-bidrag DE027551 och DE022567 (NJD).
0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |