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Medicina

El modelo Chick Chorioalantoic Membrane In Vivo para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello

Published: June 21, 2019
doi:
10.3791/59296
, , , ,
1Periodontics and Oral Medicine,University of Michigan School of Dentistry, 2Pathology,University of Michigan Medical School

Summary

La invasión perineuronal es un fenotipo agresivo para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y otros tumores. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar angiogénesis, invasión de cáncer, y metástasis. Aquí demostramos cómo este modelo se puede utilizar para evaluar la invasión perineural in vivo.

Abstract

La invasión perineuronal es un fenotipo en el que el cáncer rodea o invade los nervios. Se asocia con un mal resultado clínico para el carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello y otros tipos de cáncer. Estudios mecánicos han demostrado que la interferencia molecular entre los nervios y las células tumorales se produce antes de la interacción física. Sólo hay unos pocos modelos in vivo para estudiar la invasión perineural, especialmente para investigar la progresión temprana, antes de que se produzcan interacciones físicos nervio-tumor. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar la invasión del cáncer, porque la membrana del sótano del epitelio corético imita la del tejido epitelial humano. Aquí reutilizamos el modelo de membrana corioalantoica de polluelos para investigar la invasión perineural, injertando ganglios de raíz dorsal de rata y células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humanos en el epitelio corético. Hemos demostrado cómo este modelo puede ser útil para evaluar la capacidad de las células cancerosas para invadir el tejido neural in vivo.

Introduction

La invasión perineural (PNI) es un fenotipo poco estudiado en el cáncer, que se asocia con una alta recurrencia de la enfermedad y una mala supervivencia en pacientes con carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (HNC)1. La PNI se define microscópicamentecomo células tumorales dentro o alrededor de los nervios 2,3. Cuando se detecta PNI, es probable que los pacientes reciban terapias adyuvantes como disección electiva del cuello y/o radioterapia4,5. Sin embargo, estas terapias son agresivas y no específicas de la PNI. De hecho, no existe una terapia para bloquear la PNI, principalmente porque los mecanismos subyacentes a las interacciones nervio-tumoral todavía se entienden mal.

Diferentes mecanismos moleculares se han implicado en la atracción nervio-tumor; tumores y células estromales liberan neuropéptidos y factores de crecimiento para promover la neuritogénesis6,7. Cuando se cultivan juntos in vitro, las células HNC y los ganglios de raíz dorsal (DRG) tienen una respuesta robusta; efectos sobre la invasión de células tumorales y la neuritogénesis se pueden ver después de unos días en el cultivo6,8,9. Sin embargo, hay una falta de modelos in vivo apropiados para recapitular las interacciones tumor-nervio antes de la invasión. Aquí presentamos un modelo in vivo PNI para estudiar lasinteracciones tempranas entre las células HNC y los nervios 6. Adaptamos el modelo de membrana corioalantoica de polluelos (CAM) para incluir un componente neural, injertando un DRG en el CAM, seguido de un injerto de células cancerosas para imitar un microambiente tumoral inervado.

El modelo CAM se ha utilizado con éxito para evaluar la invasión de células a través de la membrana del sótano, imitando las primeras etapas invasivas de carcinomas y melanoma10,11,12. El CAM se compone de epitelio coriónónico superior, mesenquime intermedio y epitelio alantoico inferior. El epitelio coriónónico es estructuralmente similar al epitelio humano10,13 en que la membrana del sótano rica en colágeno-IV simula la membrana del sótano que separa el epitelio oral del tejido conectivo subyacente. Desde que se realizaron los primeros injertos tumorales en la CAM en 191314,se desarrollaron muchas adaptaciones del método para permitir la evaluación de la angiogénesis15,16,17,progresión tumoral, y metástasis18. Es importante destacar que la técnica de injertar tumores en el CAM ha cambiado muy poco, pero las aplicaciones están evolucionando continuamente. Se han publicado ensayos de creciente complejidad, incluyendo el cribado de fármacos19,la ingeniería de tejidoó óseo20y los fármacos anticancerígenos basados en nanopartículas21.

Nuestro laboratorio utiliza un modelo CAM-DRG en el que un DRG de mamífero es aislado e injertado en la superficie de la CAM superior. Después de que el DRG se incorpore en el CAM, las células HNC se injertan cerca del DRG y se les permite interactuar con el DRG antes de que todo el sistema in vivo sea cosechado y analizado. Es importante destacar que el sistema permite la observación visual ex-vivo tanto del DRG como del tumor mediante el etiquetado de fluorescencia de DRG y células tumorales. Este protocolo comprende múltiples pasos con diferentes niveles de complejidad realizados en un plazo de 17 días, desde la incubación de huevos hasta la cosecha del CAM (Figura1). Las células que expresan diferentes proteínas de interés se pueden probar en este modelo para dilucidar las vías moleculares responsables de la invasión nerviosa en el cáncer, y también para la detección de fármacos para apuntar directamente a la invasión neuronal. Las células pretratadas con un medicamento candidato se pueden injertar en el CAM y la aparición de PNI investigada en comparación con los controles no tratados. De hecho, el modelo CAM se ha utilizado para la detección de fármacos como paso intermedio entre estudios in vitro y ensayos preclínicos in vivo en roedores19.

El diseño experimental variará con la hipótesis. Por ejemplo, si se prueba el papel de una proteína específica en la PNI, el grupo experimental incluiría DRG injertado con células tumorales que sobreexpresan la proteína, mientras que el grupo de control debe incluir DRG con células establemente transtrinfectadas con vector vacío. Se pueden utilizar varios diseños experimentales diferentes para abordar preguntas específicas.

Protocol

Declaración de ética: Todos los experimentos que utilizan ratas en este protocolo se realizan de acuerdo con las reglas del IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso animal) de nuestra institución. Los experimentos con huevos en este estudio están exentos de la regulación de la IACUC. 1. Incubación de huevos (tiempo estimado: 5 min, día cero) Obtenga huevos comerciales Lohmann De pico blanco sin patógenos, preferiblemente el primer día después de la fertilización. Incubar seis huevos por grupo experimental en una incubadora humidificadora de huevos a 38oC y un 54% de humedad durante 8 días con rotación por hora. Utilice la rotación regular de los óvulos para evitar que el embrión se pegue a las membranas del óvulo.NOTA: Antes de la incubación, mantenga los óvulos en un refrigerador de 18 oC para detener el desarrollo embrionario durante un máximo de 1 semana. 2. Cosecha y preparación de DRGs (tiempo estimado: 2 h, día 8) NOTA: Los experimentos con ratones y ratas requieren la aprobación de la (IACUC). En algunos países, el uso de huevos de pollo también requiere aprobación. Obtener de seis a siete semanas de edad Sprague Dawley ratas (200 g de peso) para extraer DRGs.NOTA: Una rata debe producir 40 DRGs cervicales y torácicos. Mouse DRG también se integra en el CAM, sin embargo, las condiciones para esta especie necesitan ser optimizadas de forma independiente. En un armario de flujo laminar, cosechar DRGs de regiones cervicales y torácicas siguiendo el protocolo para la extracción de DRG de ratón publicado en otros lugares22. Siga la Figura 2 para obtener orientación sobre cómo cosechar DRGs. Eutanasia de la rata por punción cardíaca después de la administración de Ketamina/ Xylazine inyectado por vía intraperitoneal. Limpie la piel de la rata con 70% de etanol y retire la columna vertebral de la rata con una tijera. No realice la luxación cervical porque esto dañaría los DRG cervicales. Separe las regiones cervical, torácica y lumbar con la misma tijera, siguiendo la representación anatómica esquemática y las imágenes brutas proporcionadas en la Figura 2A-D. Coloque las secciones de la columna vertebral en un plato de cultivo de 10 cm con 1 PBS para mantener los tejidos húmedos. Con una delicada tijera ósea, abra los huesos vertebrales en los aspectos dorsal y ventrales, separando la columna vertebral en dos mitades laterales (Figura2E-F).  Coloque las secciones de tejido en un plato limpio de 10 cm con PBS fresco de 1x. Usando fórceps, separa suavemente la médula espinal de los huesos vertebrales para visualizar los DRG (Figura2G). Con fórceps finos sostenidos debajo de cada DRG, agárralo y sácalo de la cavidad ósea en la que está alojado. No sostenga el DRG directamente porque esto causará daño tisular. No recorte los haces de axón del DRG (Figura2H).NOTA: Evite el uso de DRGs lumbares ya que estos han reducido la integración en el CAM. Para la ubicación de la región DRG, siga la ilustración esquemática y las imágenes anatómicas gruesas en la Figura 2A-D. Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada DRG en un medio de cultivo DMEM complementado con un 2% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) y un 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor para ayudar a prevenir la contaminación bacteriana de los DRG. plato de cultivo con 4 ml de medio de cultivo. Después de cosechar todos los DRG, transfiéralos a un nuevo plato de cultivo con medio de cultivo DMEM complementado con 2% Pluma/Strep más 10% FBS y que contiene 1,25 g/ml de tinte fluorescente rojo. Incubar durante 1 h en la incubadora de cultivo celular. Durante este tiempo, prepare los huevos para recibir el DRG como se describe a continuación (paso 3).NOTA: El intervalo entre los DRG de cosecha y la finalización del etiquetado de fluorescencia debe ser suficiente para preparar los huevos; Los DRG se pueden conservar durante unas horas en la incubadora. 3. Preparación de huevos para el injerto de DRG (tiempo estimado: 1 h para una docena de huevos, día 8) En un armario de flujo laminar, atenúe la luz y transiluminar los huevos para comprobar la viabilidad y la fase embrionaria. Excluya los huevos con mala vasculatura, óvulos no fertilizados o óvulos no consistentes con el día 8 después de la fertilización. Sujete el huevo suavemente con el saco de aire natural hacia la fuente de luz (Figura3A). Con un lápiz, marque la cáscara de huevo para recibir las aberturas (Figura3A-B). En primer lugar, identificar la unión del embrión en desarrollo al CAM como un vaso en movimiento oscuro unido a la membrana del óvulo y marcar esta área para evitar intervenciones en esta región. En segundo lugar, elija el área de la ventana de operación como un área bien vascularizada al menos 2 cm del accesorio del embrión y dibuje un círculo de 1,5 cm de diámetro. Aproximadamente 1 cm de la ventana de funcionamiento, dibuje un cuadrado de 0,5 cm en un área menos vascularizada. En tercer lugar, dibuje la región del saco de aire para excluirla del área de operación. Marque el centro del saco de aire con una cruz. Con una herramienta giratoria y un taladro de grabado, de 3 mm de diámetro, taladre la cáscara del huevo en el cuadrado marcado (Figura3C). Utilice fórceps contundentes para eliminar la cáscara de huevo sin quitar la membrana externa de la cáscara de huevo (la membrana blanca justo debajo de la cáscara) (Figura3D). Trabaje cuidadosamente para evitar perforaciones accidentales de esta membrana. Usando el mismo taladro que en el paso 3.3, haga una perforación precisa en la cruz marcada en el área del saco de aire para permitir el flujo de aire en el huevo (Figura3E). Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión sobre el huevo, para evitar romperlo o dañarlo. Coloque 30 l de HBSS en la abertura cuadrada, sobre la membrana de cáscara de huevo exterior intacta (Figura3E). Con una aguja de jeringa de 30 G, haga una perforación precisa en la membrana externa en esta área cuadrada (Figura3F). Coloque el huevo en la fuente de luz para visualizar el saco de aire. Aplique presión a una bombilla de goma cuentagotas y colóquela en la pequeña perforación realizada en el área del saco de aire (paso 3.4). Liberar la presión en la bombilla hasta que vea la separación de las dos membranas en el área de la ventana de funcionamiento (Figura3G); repetir este paso tantas veces como sea necesario para lograr la separación completa de las membranas en el área de la ventana de operación. Repita los pasos 3.1-3.6 para todos los huevos. Usando el mismo taladro que en el paso 3.3, taladre la ventana de operación circular teniendo cuidado de no romper la membrana exterior de la cáscara de huevo (Figura3H). Limpie la superficie del huevo pegando suavemente una cinta adhesiva para eliminar todas las partículas sueltas. Con fórceps contundentes, retire la cáscara de huevo del área perforada (Figura3I-J). A continuación, con los mismos fórceps, retire la membrana externa de la cáscara de huevo (Figura3K),teniendo cuidado de no introducir pequeñas partículas de cáscara dentro del huevo para minimizar la contaminación. Identifique el CAM aproximadamente a 1 cm de profundidad de la superficie del huevo. Cubra cada huevo abierto temporalmente con membrana de cera de parafina para evitar la contaminación (Figura3L). Repita los pasos 3.8-3.10 para todos los huevos. Coloque los huevos de nuevo en la incubadora de óvulos sin rotación hasta que los DRG estén listos para el injerto. 4. Injerto de DRG en el CAM (tiempo estimado: 40 min, día 8) Preparar un plato de cultivo de 6 cm con medio HBSS, para lavar los DRG antes de la implantación. Lleve los huevos preparados al gabinete de flujo laminar de cultivo celular. Retire la membrana de la parafina del huevo (Figura4A). Con fórceps estériles finos, agarre suavemente un DRG desde el interior del medio de cultivo. Sumérgelo en el medio HBSS para eliminar el exceso de medio que contiene el tinte fluorescente. Sostenga el DRG muy suavemente; de lo contrario, se pegará a los fórceps. Coloque el DRG en el CAM, teniendo cuidado de no perforar la membrana (Figura4B-C). Si es necesario, utilice otro par de fórceps para ayudar a separar el DRG de la punta de los fórceps al colocarlo en el CAM.NOTA: Mantener el DRG húmedo con medio HBSS también facilitará el desprendimiento de los fórceps. Cubra el huevo con un apósito de película transparente estéril. Cubrir todas las ventanas y pinchazos realizados en la cáscara del huevo para evitar la contaminación bacteriana (Figura4D). Después de injertar los DRG en todos los huevos, incubar los huevos en una incubadora humidificadora a 38oC y 54% de humedad durante 2 días, sin rotación. 5. Injerto de células tumorales en el CAM (tiempo estimado: 1 h 30 min, día 10) A 48 h antes de injertar las células, placa las células necesarias en las placas de cultivo. Calcular 0.5 a 1 x 106 células por huevo para las células UM-SCC-1 con el fin de generar tumores tridimensionales en el CAM. Tenga en cuenta que el número de celda puede variar según la línea de celda. Aspirar el medio y añadir el medio de cultivo DMEM complementado con 1% Pluma/Strep más 10% FBS y 2,5 g/ml de tinte fluorescente verde. Incubar durante 1 h a 37oC en la incubadora de cultivos celulares. A continuación, compruebe la intensidad de la fluorescencia en el microscopio, aspire el medio, lave una vez con 1x PBS, y agregue 0.25% de trippsina hasta 10 min. Neutralice la trippsina con el medio suplementado DMEM. Centrífuga a 250 x g durante 4 min para formar un pellet celular. Aspirar el medio DMEM y volver a suspender en HBSS para lavar el exceso de tinte fluorescente. Cuente las células usando un hemocaquítómetro. Lleve los huevos al gabinete de flujo laminar de cultivo celular. Con tijeras y fórceps, abra el apósito de película transparente que cubre el huevo (Figura4E-F). Centrifugar de nuevo el número calculado de células, aspirar el medio HBSS y volver a suspenderlo a una concentración final de 0,5 a 1×106 células por 5 sL del mismo medio (Figura4G). Preparar la cantidad necesaria para el número total de huevos (5 ml de suspensión celular por huevo). Coloque 5 sal de solución de celda en el CAM, aproximadamente 2 mm del DRG (Figura4H). Mantenga distancias uniformes entre el DRG y las células. Tenga mucho cuidado de no molestar el óvulo para minimizar la propagación de las células.NOTA: Para iniciar la implantación celular, elija los huevos en los que la superficie CAM esté visualmente seca. Si la superficie está demasiado húmeda, las células pueden diseminarse y no forman tumores regulares. Cubra el huevo con un nuevo apósito de película como en el paso 4.4. Injertar las células en todos los huevos. Incubar los huevos en una incubadora humidificadora a 38oC y 54% de humedad durante 7 días, sin rotación. 6. Cosecha de la CAM (tiempo estimado: 1 h para la docena de huevos, día 17) Preparar placas de 6 pocillos con 4% PFA (paraformaldehído) pH7.0, un pozo por huevo, 2 mL por pozo. Lleva los huevos a un banco de laboratorio. Usando una aguja unida a una jeringa para perforar el apósito de película, deje caer alrededor de 300 ol de PFA sobre el CAM para endurecer ligeramente el CAM, facilitando así el proceso de cosecha. Repite esto para todos los huevos. Con una tijera, retire la mitad superior de la cáscara de huevo (donde se encuentra la ventana de operación) con el CAM unido a ella (Figura4I). Reducir el tamaño de esta mitad a aproximadamente 3 cm de diámetro, manteniendo la porción del CAM donde DRG y las células tumorales fueron injertados en el centro (Figura4J). Sujete el CAM con fórceps finos y despártelo de la cáscara de huevo mientras lo coloca en el PFA. Orientar el DRG y las células cancerosas mirando hacia arriba (Figura4K-L).NOTA: El área de 3 cm debe incluir tanto el DRG como las células. El DRG es fácilmente visto como un pequeño bulto unido en el CAM, sin embargo las células tumorales a veces son difíciles de identificar en el examen bruto. Alternativamente, con una tijera, ensanche la ventana de operación quitando la cáscara de huevo de la parte superior del huevo mientras mantiene el CAM en su lugar; quitar aproximadamente 1 cm más allá de la ventana de funcionamiento (Figura4M)e identificar el DRG y las células en el CAM (Figura4N-O). Con delicados fórceps finos, sostenga el CAM en uno de los bordes y levántelo suavemente. Con tijeras delicadas y afiladas, corte suavemente el CAM para eliminar un área circular, de aproximadamente 3 cm de diámetro (Figura4P),y coloque el CAM en PFA con DRG y células cancerosas mirando hacia arriba.NOTA: Evite estirar o sostener el CAM con fórceps en varios lugares para minimizar el daño tisular que puede generar artefactos de microscopía. Coloque cada membrana CAM en un pozo (Figura4L). Sujete suavemente los bordes del CAM para extender el tejido abierto en el PFA o agite suavemente la placa hasta que se despliega el CAM, para evitar artefactos plegables. Eutanasia el embrión (día 17) mediante una rápida decapitación. Fijar los tejidos cosechados en PFA durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de la fijación, reemplace el PFA por 1x PBS y almacene los tejidos en PBS a 4 oC hasta que se incrusten en parafina para su seccionamiento. Evite la fijación excesiva que dañará la delicada vasculatura del CAM. Usando un estereomicroscopio de fluorescencia, fotografíe las membranas dentro de los 2 días posteriores a la cosecha para evitar la pérdida de señales fluorescentes.

Representative Results

Cuando se optimiza, este método tiene casi 100% de integración DRG en el CAM. Los resultados representativos de la integración de DRG se muestran en la Figura 5A-B. La integración de DRG en el CAM es importante ya que proporciona viabilidad al tejido DRG durante el experimento. Microscópicamente, el DRG se ve dentro del tejido conectivo del CAM (mancha H&E). Los vasos sanguíneos se ven a menudo dentro del tejido DRG, lo que sugiere que el suministro de sangre CAM está nutriendo el tejido injertado. Los tumores implantados también se identifican en el CAM por H&E; dependiendo de la cantidad de invasión presente, los tumores podrían presentarse sin ninguna a numerosas islas tumorales invadiendo el tejido conectivo (Figura5C-D). La Figura 5E-F representativa muestra el CAM cosechado en imágenes de campo brillante y fluorescencia fusionada. Células UM-SCC-1 que sobreexpresan el receptor de Galanin 2 presentaron una mayor invasión del DRG en comparación con las células de control (Figura5G-H). La interacción cáncer-DRG se observa como células cancerosas que presentan invasión direccional hacia el DRG (Figura5H). El análisis de datos se realiza de diferentes maneras. La invasión direccional de las células cancerosas hacia el DRG se observa como una variable dicotómica y el número de óvulos que presentan este patrón de invasión se cuenta en cada grupo. Las diferencias estadísticas entre grupos se calculan utilizando una prueba binomial de proporciones. La proximidad entre las células cancerosas y el DRG, y el área del tumor se miden usando ImageJ6 y las diferencias entre los grupos se evalúan usando la prueba t del estudiante. Para garantizar la precisión con el análisis ImageJ, todas las imágenes del mismo experimento deben tomarse en los mismos ajustes de luz y exposición. Después de ajustar el umbral de imagen y el brillo de todas las imágenes utilizando los mismos criterios, la herramienta Analizar partículas se utiliza para medir el área del tumor y la herramienta de medición lineal mide las distancias tumor-DRG. Es importante utilizar la configuración constante del tamaño de las partículas analizadas para todas las imágenes en diferentes grupos. En algunos casos, los tumores crecen más gruesos y se pueden medir manualmente con una pinza digital, lo que permite una medición del volumen. Se pueden realizar secciones de tejido CAM incrustado en parafina, manchas de H&E o inmunohistoquímica para células epiteliales (anticuerpos anticitoqueratinas reactivos para especies humanas), lo que permite evaluar la invasión dentro del tejido conectivo. La invasión se cuantifica como el número de islas tumorales en el tejido conectivo por huevo. La inmunofluorescencia para el colágeno IV se puede utilizar para resaltar la membrana del sótano. Además, si se utilizan células cancerosas etiquetadas con GFP, la identificación de estas células en las secciones tisulares se facilita sin una inmunohistoquímica para la citoqueratina. La metástasis y el análisis de la angiogénesis en experimentos CAM se discuten en otros lugares10,17. Figura 1: Cronología del experimento, incluidos los pasos principales de los días 0, 8, 10 y 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Extracción de DRG el día 8 . Un. Esquema de rata que ilustra la ubicación anatómica de la columna vertebral. B. Diagrama de la configuración de las vértebras de rata que muestra diferentes regiones del cuerpo; verde para el cuello uterino, azul oscuro para torácico, naranja para lumbar y azul claro para las vértebras sacras. C-D. Aspecto ventral de la columna vertebral de la rata después de la escisión quirúrgica; separación de las regiones como se ilustra en B. E. Disección de las vértebras para abrir el canal de la médula espinal, separando los cuerpos vertebrales en dos secciones laterales que contienen los DRG. F. Aspecto bruto de la columna torácica abierta. G. Después de desplazar la médula espinal, los DRG son fácilmente visibles en los canales vertebrales (cabezas de flecha que apuntan a 3 DRG). H. Imagen estereomicroscópica de un DRG (flecha) con los correspondientes haces de axón (cabeza de flecha). Barras de escala: C, D, F, y G, 1 cm; H, 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Preparación de los huevos el día 8. A-B. Identificación de la vasculatura de huevo y marcas antes del procedimiento. Flechas en Un punto al saco de aire natural. C-D. Perforación y apertura de la cáscara de huevo en la marca de apertura cuadrada. Flecha en D apunta a la membrana de la cáscara de huevo exterior intacta después de quitar la cáscara con la ayuda de fórceps contundentes. E. La cruz marcada en el saco de aire se perfora con el taladro para permitir el flujo de aire en el huevo (cabeza de flecha). 30 l de medio HBSS se coloca sobre la membrana exterior de la cáscara de huevo en la abertura cuadrada. F. Con una aguja de jeringa fina, la membrana exterior de la cáscara del huevo se perfora donde se colocó previamente el HBSS. G. La presión se aplica a una bombilla cuentagotas de goma mientras se une a la perforación perforada en el saco de aire. Cuando se libera la presión de los dedos, se aspira el aire, generando un saco de aire artificial (flechas blancas) que debe extenderse a la ventana de operación. H. Los bordes de la ventana de operación se perforan en una posición casi paralela a la cáscara del huevo, para evitar perforaciones accidentales. I-J. Eliminación de la cáscara de huevo con fórceps contundentes. K. Retire la membrana exterior de la cáscara de huevo con fórceps contundentes, teniendo cuidado de no introducir partículas en el CAM (observado a 1 cm por debajo de la superficie). L. Los huevos se cubren temporalmente con una membrana de cera de parafina y se vuelven a colocar en la incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Injerto de DRG, células, y cosecha de CAM: El día 8: A. CAM fácilmente observado después de la eliminación de la membrana de cera de parafina. B-C. Con fórceps finos, DRG se coloca en el CAM. D. El huevo está cubierto con aderezo de película y se pone en la incubadora; las flechas apuntan a las aberturas que están cubiertas. El día 10: E-F. Se retira el apósito de película y se encuentra DRG (cabeza de flecha en F). G-H. 5 l de solución celular se deja caer sobre el CAM a una distancia de 2 mm del DRG. En el día 17: I-L y M-P demuestran dos enfoques diferentes utilizados para cosechar el CAM. I. Cáscara de huevo se abre con una tijera fina que comienza en el saco de aire perforación perforada hasta que se retira la mitad superior del huevo. J. La cáscara de huevo que contiene el CAM se reduce en tamaño a aproximadamente 3 cm. K-L. Con fórceps finos, CAM se separa de la cáscara de huevo y se coloca en PFA. M-O. El ensanchamiento de la ventana de operación se realiza para visualizar el DRG y las células cancerosas en el CAM. Arrowhead apunta al tumor y la flecha apunta al DRG. P. El CAM se sujeta con fórceps finos, se corta con una tijera afilada y se coloca en PFA como se muestra en L. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Resultados representativos. A. Sección de H&E que muestra la integración del DRG en el CAM. B. Mayor aumento de A; flechas muestran los vasos sanguíneos CAM en el DRG. C. Células UM-SCC-1 injertadas en el CAM y cosechadas cuatro días después del injerto (mancha H&E). D. Mayor aumento de C que muestra islas tumorales invasivas en el tejido conectivo CAM (flechas). E. Imagen estereomicrocópica bruta del CAM injertado con células UM-SCC-1-GALR2 y DRG de rata, cosechada el día 17. F.Fluorescencia fusionada e imágenes de campo brillante que resaltan el DRG etiquetado en rojo y células cancerosas etiquetadas en verde. G-H. Estereomicroscopía por fluorescencia del CAM injertado con DRG y UM-SCC-1-GALR2 frente a las células de control, lo que ilustra la invasión direccional de células UM-SCC-1-GALR2 al DRG (H). Barras de escala: A-D, 500 m; E-H, 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Paso Problema Razón Solución 3.2.1 Incapaz de identificar el accesorio embrionario. La posición del accesorio es difícil de ver mientras el huevo está quieto. Gire el huevo rápidamente hacia los lados para poder ver un vaso largo unido a la membrana del huevo. 3.3 y 3.8 Perforación de la membrana exterior de la cáscara de huevo durante la perforación. Posicionamiento incorrecto del taladro. Coloque el taladro casi paralelo a la cáscara de huevo durante la perforación. Si la membrana se perfora en el paso 3.3 , no hay necesidad de realizar perforaciones adicionales con la aguja como se indica en el paso 3.5. Si ocurre sangrado, deseche el óvulo. 4.3 DRG se adhiere a los fórceps. DrG está seco. Humedezca DRG de nuevo en HBSS y/o use una aguja fina para ayudar a separar el DRG de los fórceps. 5.2 Las células no están perfectamente etiquetadas con tinte fluorescente. Tiempo de incubación. Algunas células requieren más tiempo para etiquetar. Conservar las células durante una hora adicional en soportes con tinte fluorescente. 5.6 Burbuja de aire en la caída de la célula. Usando todo el líquido en la punta de la pipeta. Cargue 1 l más que el volumen deseado y no utilice el l final de la pipeta al implantar las células. Esto evitará que las burbujas de aire en la mezcla de células. 6.3 No se puede identificar DRG o células al cosechar el CAM. Pequeño DRG, DRG se desplazó, las células cancerosas se propagaron. Si no se ve DRG, cosecha un área más grande de la CAM y colócala en un recipiente más grande para la fijación. Compruebe la DRG y la posición de la célula bajo fluorescencia en un microscopio estéreo, y luego recorte el CAM a un tamaño más pequeño para la incrustación de parafina. Tabla 1: Tabla de solución de problemas

Discussion

El modelo CAM-DRG in vivo presentado aquí aborda los déficits de modelos anteriores demostrando la interacción nervio-tumor antes de la invasión física del nervio por las células tumorales. Los estudios más in vivo de PNI se centran en la propagación tumoral y la inhibición de la función motora, y dependen de la inyección directa de células tumorales en los nervios ciáticos23,24,25. La inyección del nervio ciático es un modelo in vivo de PNI donde las células cancerosas se inyectan en un nervio ciático de ratón o rata donde el tumor crece posteriormente. Los modelos de inyección son útiles para mostrar la progresión del tumor destructivo y el dolor resultante de las células tumorales dentro de los nervios. El modelo de nervio ciático también es adecuado para el estudio de factores que permiten que las células cancerosas prosperen en el nervio pero carece de la capacidad de evaluar la fase temprana de la PNI, porque introduce las células directamente en el nervio, evitando las vainas nerviosas. En un enfoque diferente, se utilizaron injertos tumorales ortotópicos implantados quirúrgicamente para caracterizar la importancia de las fibras nerviosas adrenérgicas y colinérgicas en la promoción de la progresión del cáncer de próstata, lo que sugiere un papel prominente de los nervios en la progresión tumoral 26. Este modelo consistió en la ablación química de los nervios murinas simpáticos y parasimpáticos. Las fibras parasimpáticas se infiltraron en los tejidos tumorales, un proceso relacionado con la PNI, pero el modelo no se utilizó específicamente para evaluar las interacciones físicas entre el nervio y el tumor. El modelo CAM-DRG permite investigar las interacciones entre el nervio y el cáncer durante la PNI. Además, los modelos murinos son caros y consumen mucho tiempo en comparación con el modelo CAM. Sugerimos utilizar el modelo CAM-DRG para estudios mecánicos de PNI.

Algunas ventajas del enfoque CAM-DRG incluyen la evaluación de PNI y otros fenotipos, como el crecimiento tumoral, la metástasis y la angiogénesis. La identificación del ADN humano en la CAM inferior y/o en el hígado se puede utilizar para la detección de metástasis de las líneas celulares de cáncer humano10,un enfoque experimental más sensible en comparación con la sección y tinción de tejido, que puede no revelar pequeñas metástasis.

El método CAM-DRG tiene algunas limitaciones, incluyendo el marco de tiempo de observación corto. El sistema inmunitario del embrión es fisiológicamente activo para el día 1827,cuando el rechazo y un proceso inflamatorio pueden tener lugar, limitando el tiempo experimental. También es importante tener en cuenta la distancia al injertar células tumorales cerca del DRG; mayores distancias de cáncer de DRG podrían afectar las interacciones moleculares entre las células tumorales y los nervios, o podrían retrasar el contacto físico entre ambos componentes del modelo. Además, si los embriones son más antiguos de lo estipulado en este protocolo, los movimientos embrionarios podrían desplazar las células tumorales. Por lo tanto, es importante utilizar huevos consistentes con el día 10 después de la fertilización para el injerto celular.

Dado que el sistema inmunitario no está completamente desarrollado antes del día 1827,el microambiente tumoral en la CAM es similar al de los modelos murinos inmunosuprimidos que se utilizan a menudo para estudios oncológicos. Por lo tanto, este modelo no es útil para evaluar el papel de las células inmunitarias en la progresión tumoral. Otra limitación es la disponibilidad restringida de reactivos para especies de pollos, como anticuerpos, citoquinas e imprimaciones.

La realización precisa de este protocolo requiere práctica; sin embargo, puede ser hecho por un miembro del laboratorio sin necesidad de una instalación central especializada. La perforación de la cáscara de huevo requiere entrenamiento. Se recomienda practicar en huevos de alimentación (no fertilizados) antes de intentar este modelo por primera vez. Se puede lograr una alta supervivencia embrionaria y el éxito del modelo si se siguen algunos pasos críticos para evitar la infección: profilaxis antibiótica apropiada de DRGs en 2% Pen/Strep, trabajando en un gabinete de flujo laminar, y evitando la dispersión de partículas de cáscara de huevo en el CAM. También es crucial mantener la humedad estable durante el tiempo total de incubación del huevo. Recomendamos aumentar el número de huevos por grupo hasta que se domine la técnica. Los problemas más frecuentes para el personal de laboratorio inexperto son la contaminación por óvulos y la técnica inexacta para el injerto celular.

La recolección de DRG también requiere capacitación; práctica en la recolección de DRGs para experimentos in vitro8 antes de intentar el modelo in vivo se recomienda. El cultivo DRG in vitro es una oportunidad para optimizar las condiciones y mejorar la técnica para acortar la duración de la extracción de DRG. Se requiere especial atención a la técnica de cosecha al agarrar el DRG con fórceps. El DRG no debe ser retenido directamente; presión debe aplicarse debajo de ella. Recomendamos el uso de lente de aumento para visualizar mejor el DRG durante la extracción.

Es importante destacar que al realizar este modelo por primera vez, todas las condiciones deben optimizarse para la línea de celda deseada. Este modelo fue optimizado para DRG de rata y la línea de células HNC UM-SCC-1. El uso de DRG de ratón y otros tipos de células cancerosas puede requerir optimización. Con una mayor concentración de células injertadas, los tumores tienden a crecer más gruesos y rígidos, lo que facilita las mediciones tumorales. Teniendo en cuenta múltiples óvulos para cada grupo y una concentración adecuada de células para cada óvulo, pueden ser necesarios varios millones de células para cada experimento. Para facilitar la planificación, se debe tener en cuenta el conocimiento del tiempo de duplicación de las células. Para algunos pasos críticos en este protocolo, se proporciona una tabla de Troubleshooting (Tabla1).

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH/NIDCR DE027551 y DE022567 (NJD).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco # 25200-056
ACE light source SCHOTT North America, Inc. Used to transilluminate the eggs
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye Life Technologies # C7025 Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium.
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye Life Technologies # C34552 Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium
Cordless rotary tool DREMEL # 866 Used to drill the egg shell
DMEM (1x) Gibco # 11965-092 Dulbeecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Fisher Bioreagents # BP231-100 Dimethyl Sulfoxide
Dumont # 5 fine forceps Fine Science Tools (FST) # 11254-20 Used to harvest DRG
Egg incubator GQF  Digital Sportsman # 1502 Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls
Engraving cutter DREMEL # 108 Used to drill the egg shell
Extra fine Graefe forceps, curved Fine Science Tools (FST) # 11151-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Extra fine Graefe forceps, straight Fine Science Tools (FST) # 11150-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. 
Filter Forceps EMD Millipore # XX6200006P Blunt forceps used to remove the egg shell
Fine surgical straight sharp scissor Fine Science Tools (FST) #14060-09 Used to harvest the CAM tissue on day 17
HBSS (1x) Gibco # 14025-092 Hank`s Balanced Salt Solution
HI FBS Gibco # 10082-147 Heat-inactivated Fetal Bovine Serum
Paraffin wax membrane Parafilm laboratory film # PM-996 Used to  temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8
PBS (1x) pH 7.4 Gibco # 10010-023 Phosphate Buffered Saline
Pen/Strep Gibco # 15140-122 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin
PFA (paraformaldehyde solution) Sigma-Aldrich # P6148-1KG Dilute in water to make a 4% PFA solution
Sprague Dawley rats (females) Charles River laboratories Strain code: 001 6-7 weeks old (190-210g in weight)
Tegaderm Transparent Film Dressing 3M # 9505W Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation
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Referências

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Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., D’Silva, N. J. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59296, doi:10.3791/59296 (2019).
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