Den här metoden är embryonala hjärt vävnader kirurgiskt microdissected, skiljas, fluorescently märkt och implanteras i värd embryonala vävnader. Detta ger en plattform för att studera enskilda eller vävnad nivå utvecklande organisationen under ektopisk hemodynamik och/eller förändrad parakrin/juxtacrine miljöer.
Tolka den relativa effekten av cell autonoma mallning kontra yttre microenvironmental inflytande på cell härstamning bestämning utgör en allmän utmaning i utvecklingsbiologi forskning. I embryonala hjärtat, detta kan vara särskilt svåra som regionala skillnader i uttrycket av transkriptionell tillsynsmyndigheter, parakrin/juxtacrine signalering ledtrådar, och hemodynamiska kraft är alla kända för att påverka hjärtmuskelcellen mognad. En förenklad metod att förändra en utveckla hjärtmuskelcellen molekylär och biomekaniska närmiljön skulle därför fungera som en kraftfull teknik för att undersöka hur lokala villkor inflytande cell öde och funktion. För att lösa detta, har vi optimerat en metod för att fysiskt transplantera juvenil hjärtmuskelceller till ektopisk platser i hjärtat eller omgivande embryonal vävnad. Detta tillåter oss att undersöka hur microenvironmental villkor inflytande hjärtmuskelcellen öde övergångar på enstaka cell upplösning inom intakt embryot. Här beskriver vi ett protokoll där embryonala myocyter kan vara isolerade från en mängd hjärt sub-domäner, skiljas, fluorescently märkt och microinjected in i värd embryon med hög precision. Cellerna kan sedan direkt analyseras på plats med hjälp av olika tekniker för avbildning och histologiska. Detta protokoll är ett kraftfullt alternativ till traditionella ympning experiment som kan vara oöverkomligt svårt i en glidande vävnad såsom hjärtat. Disponeras av denna metod kan också anpassas till en mängd olika givare vävnader och värdmiljöer och dess användarvänlighet, låga kostnader, och hastighet gör det en potentiellt användbar applikation för en mängd olika utvecklande studier.
Hjärt utvecklings forskning har gynnat enormt från tillkomsten av könsceller transgena modellsystem som kartlagt många av de gen regleringsnät att mönster annan cell härstamningar och funktionella domäner i hjärtat. Att identifiera kan hur dessa gen nätverk interagerar med och svara på microenvironmental villkor, inklusive parakrin/juxtacrine signaler och biofysiska ingångar (stretch, stam, hemodynamiska flöde), dock vara utmanande. Som sådan, är det inte alltid lätt att avgöra huruvida en cellulär fenotyp uppstår som en direkt följd av en genetisk störning eller som ett sekundärt resultat av en anpassning till förändringar i hjärtats biomekanik eller högre ordning vävnad sammansättning1,2 .
Ympning experiment, som klassiskt använts till adress begrepp av öde specifikation, skulle engagemang, induktion och kompetens3,4, utgöra en perfekt metod att kringgå några av utmaningarna som definiera cell autonoma kontra miljöpåverkan i hjärtat. Tyvärr, hjärtat sammandragningar försvårar ympning standardmetoder. Snabb förflyttning av vävnad hindrar ofta ympade celler från ansluter sig till hjärtat och stora vävnad punkteringar (normalt krävs för ympning) ofta leda till hjärtsvikt och embryonal dödlighet5,6,7. Därför har vi utvecklat en tryck-baserade, Mikroskop system för precision cellulära implantering i utvecklingsländer chick hjärtat, kringgå de tekniska hindren för vävnad ympning beskrivs tidigare8,9. Med denna teknik, kan enskilda eller små grupper av hjärtats celler isolerade från en donator embryot vara microinjected till olika regioner i ett värd embryonala hjärta vilket eliminerar behovet av omfattande värd förberedelse och stor vävnad förolämpningar som uppstår med ympning standardtekniker. Mikroskop nålar används för dessa implantation studier har en yttre diameter på ~ 30−40 µm, vilket innebär att nålen kan placeras direkt i målvävnaden (dvs kan penetrera embryonala hjärtinfarkt väggen) och celler kan levereras focally med minimal skada på omgivande vävnad. Protokollet kan användas för att utföra en mängd isotopiska, heterotop, isochoric och heterochronic manipulationer, som ger en snabb, flexibel och billig metod för att direkt undersöka klassisk experimentell embryologiska paradigm i utvecklingsländerna fyrkamrat hjärta.
I protokollet som beskrivs nedan, vi märka givare celler med en cell diffusionskoefficient fluorescerande färgämne, som gör för att lyckas med ett Mikroskop experiment som ska övervakas i realtid och placeringen av rekonstituerades celler dokumenteras utan behov av någon ytterligare färgning. Det bör dock noteras att detta tillvägagångssätt är bäst lämpad för kort sikt experiment (ca 48 h) som den fluorescerande färgämnen kan förloras genom celldelning. Alternativa metoder kan användas för längre sikt experiment.
Medan vi presenterar denna teknik i samband med hjärt utveckling, har vi använt det till stor effekt för cell implantation experiment i mesoderm, huvud, armar och ben och thoraxsegmenten. Som sådan den grundläggande strategi som beskrivs nedan är mycket lätthanterlig och kan användas i en mängd olika organsystem.
Möjligheten att definiera hur microenvironmental villkor påverkar hjärt cell öde specifikation och härstamning stabilisering är grundläggande för att skapa en tryckkraft förståelse av kongenital hjärtsjukdom samt att utveckla effektiva protokoll för korrekt mognaden av stamceller eller somatisk reprograming-baserade hjärtmuskelcellerna. Protokollet beskrivs ovan ger utredarna möjligheten till direkt assay hjärt cell utveckling under ändras förhållandena in vivo, möjliggör autonoma mognad cellprocesser separeras från parakrin/juxtacrine och/eller hemodynamiska cues. Kombination med hög upplösning imaging, genetisk analys och fysiologiska analyser, kan denna teknik fungera som ett kraftfullt komplement till befintliga transgena modeller.
Bilda en teknisk stå punkt, det protokoll som presenteras här bygger på effektiv isolering, märkning och precisa implantering av givare hjärtceller i värd embryonala vävnader. Användning av ett Mikroskop system kraftigt stöd i inriktningen av donatorcellerna och möjliggör lyckad implantation utan behovet av att skapa en stor engraftment webbplats i värd vävnaden. Vissa operativa skicklighet krävs för att utföra denna teknik dock eftersom minskad lönsamhet kan leda om injektionsnålen inte placeras noggrant i målvävnaden (orsakar bristning i hjärtat eller lokala vaskulatur). Omsorg och eftertanke bör också ges till isolering och märkning trappan. Med matsmältningen givarens vävnad kan leda till dålig implantation effektivitet och övergående märkning tekniker kan begränsa tidsramen som donatorcellerna kan spåras (som celldelning kan späda ut etiketten).
Denna teknik mycket kan ändras och kan anpassas för olika ändamål. Exempelvis injiceras givare celler från ett stort utbud av vävnader och stadier kan vara isolerade (även om det krävs optimering av enzymatisk nedbrytning) och kan likaså i en mängd värden vävnader över olika stadier av utveckling. Likaså kan den märkning metoden ändras för att spåra celler mellan olika windows-temporal, inklusive användning av fluorescerande oorganiska halvledare nanokristaller för längre övergående märkning och implantation av vaktel celler eller celler från green fluorescerande protein transgena (GFP +) givare embryon11 för diffusionskoefficient märkning.
Medan vi för närvarande använder denna teknik för aviär implantation studier, anser vi att det skulle kunna användas för ett stort antal chimära studier i framtiden. Till exempel kunde genetiskt förändrade hjärtats celler från transgena organismer vara isolerade och microinjected in aviär hjärta med ett mycket liknande protokoll. Dessutom celler differentieras efter hjärtmuskelcellerna från stjälkar celler eller via somatiska celler reprograming metoder kunde vara microinjected i den embryonala hjärtan att utvärdera deras integrering i den vävnad eller mognad under invivo biomekaniska villkor.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av grant R00HL122360 från National Institutes of Health, nationella hjärta, lungor och blod Institute (NHLBI).
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |