Hemming av Aspergillus flavus vekst og Aflatoxin produksjon i transgene mais uttrykke den α-amylase Inhibitor fra Lablab purpureus L.
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere Aspergillus flavus vekst og aflatoxin produksjon i mais kjerner uttrykke en soppdrepende protein. Bruke en GFP-uttrykke A. flavus belastning overvåket vi infeksjon og spredning av soppen i eldre kjerner i sanntid. Analysen er rask, pålitelig og reproduserbar.
Abstract
Aflatoxin forurensning i mat og fôret avlingene er en stor utfordring over hele verden. Aflatoxins, produsert av soppen Aspergillus flavus (A. flavus) er potente kreftfremkallende som betydelig reduserer beskjære verdien i mais og andre olje rike avlinger som peanut foruten posing alvorlig trussel mot mennesker og dyr sunnhet. Ulike tilnærminger, inkludert tradisjonelle avl, transgene uttrykket av motstanden forbundet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-basert vert-indusert genet stanse kritiske A. flavus genet mål, evalueres for å øke aflatoxin motstand i utsatt avlinger. Tidligere studier har vist en viktig rolle for α-amylase i A. flavus patogenesen og aflatoxin, antyder dette genet/enzymet er et mulig mål å redusere både A. flavus vekst og aflatoxin produksjon. I denne forbindelse, ble denne studien gjennomført for å vurdere heterologous uttrykk (under kontroll konstituerende CaMV 35S ) for en Lablab purpureus L. α-amylase inhibitor som protein (AILP) i mais mot A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en konkurransedyktig hemmer av A. flavus α-amylase enzym og tilhører Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer protein familien felles bønne. In vitro studier før arbeidet hadde vist AILP rolle i Hemming av A. flavus α-amylase aktivitet og soppvekst. Soppvekst og aflatoxin produksjon i eldre kjerner ble kartlagt i sanntid ved hjelp av en GFP-uttrykke A. flavus belastning. Denne kjernen screening analysen (KSA) er svært enkelt å sette opp og gir pålitelig og reproduserbar infeksjon og omfanget av spredning som kan kvantifiseres for evaluering av germplasm og transgene linjer. Fluorescens fra GFP stammen er nært korrelert til sopp vekst, og dermed er det godt korrelert til aflatoxin verdier. Målet med arbeidet var å implementere denne forkunnskaper i en kommersielt viktig avling som mais å øke aflatoxin motstand. Våre resultater viser en 35%-72% reduksjon i A. flavus vekst i AILP-uttrykke transgene mais kjerner som igjen oversettes til 62%-88% reduksjon i aflatoxin nivåer.
Introduction
Mycotoxin forurensning av sopp slektene, Aspergillus, Fusarium, penicillinog Alternaria er et stort problem av næringen og mate avlinger vokst verdensomspennende1,2,3. Blant disse phytopathogenic sopp har Aspergillus størst ugunstig innvirkning på beskjære verdi og dyrs og helse. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk anlegget patogen som infiserer olje rike avlinger som mais, bomullsfrøolje og peanut og produserer potente kreftfremkallende stoffer, aflatoxins, samt mange giftige sekundære metabolitter (SMs). Mais er et viktig mat og mate avling dyrkes over hele verden og er svært utsatt for forurensning av A. flavus. Den økonomiske virkningen av aflatoxin forurensning på taper og redusert verdien i mais kan være så mye som $686.6 millioner/år i USA2 anslåtte endringer i globale klima, virkningen av aflatoxins kan resultere i større økonomiske tap i mais med estimater så høyt som $1.68 milliarder i året i nær fremtid2. Gitt de negative økonomiske og helsemessige effektene av aflatoxins hos mennesker og husdyr, kan før innhøsting aflatoxin kontroll i mais være den mest effektive måten å hindre aflatoxin forurensning i mat og fôr produkter.
Den store før innhøsting kontroll tilnærmingen for aflatoxin motstand i mais som har vært brukt mye i de siste tiårene er primært gjennom formering, som krever en betydelig mengde tid4. Nylig har biocontrol hatt suksess i aflatoxin reduksjon i stor skala feltet programmer5,6. Foruten biocontrol, har bruken av banebrytende molekylære verktøy som ‘Host indusert Gene Silencing’ (HIGS) gjennom RNAi og transgene uttrykk for motstand-assosiert proteiner hatt suksess i reduksjon av A. flavus vekst og aflatoxin produksjon i liten skala laboratory og felt studier. Disse metodene er optimaliseres i tillegg til å identifisere nye potensielle A. flavus genet mål for fremtidige manipulasjon.
Foruten gener som er direkte involvert i mycotoxin produksjon som potensielle mål av transgene kontroll strategier, har sopp amylases vist seg å spille en avgjørende rolle i å opprettholde vellykket patogenese og mycotoxin produksjon i tidlige fasen verten anlegget infeksjon. Noen eksempler er Pythium pleroticum (kausal agent av ingefær rhizome råte), Fusarium solani (kausal agent av blomkål wilt), der positive sammenhenger mellom virusets og α-amylase uttrykk og aktivitet ble observert 7,8. Hemming av α-amylase aktivitet enten gjennom genet knockout eller pusse tilnærminger påvirker negativt fungal vekst og gift produksjon. En α-amylase knockout mutant av A. flavus klarte ikke å produsere aflatoxins når dyrket på stivelse substrat eller degermed mais kjerner9. Tilsvarende i Fusarium verticillioides mislyktes en α-amylase knockout belastning å produsere fumonisin B1 (mycotoxin) under infeksjon mais kjerner10. En nyere studie viste Gilbert et al. (2018) at en RNAi-baserte slå ned A. flavus α-amylase uttrykk, via HIGS betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon11 .
Bestemt hemmere α-amylase aktivitet har også produsert lignende resultater som hentes fra ned-regulering av α-amylase uttrykk. Den første rapporten om rollen som en α-amylase hemmer i fungal motstand kom fra isolering og karakterisering av en 14-kDa trypsin-α-amylase hemmer fra mais linjer motstandsdyktig mot A. flavus12. Ytterligere screening av flere hundre av plantearter av Fakhoury og Woloshuk førte til identifisering av en 36-kDa α-amylase inhibitor som protein (AILP) fra frø av Jacinto bønner, Lablab purpureus L.13. Peptid sekvensen av AILP lignet lectins Lektiner-arcelin-α-amylase hemmer gultrefamilien rapportert felles bønne14,15. Renset AILP viser ikke noen hemmende aktivitet mot pattedyr trypsin og videre i vitro karakterisering viste betydelig hemming av A. flavus vekst og conidial spiring13. Rapporter presentert her tydelig viser α-amylase kan fungere som et mål i kontroll tilnærminger til begrense patogener eller skadedyr som avhenger av stivelse mobilisering (gjennom α-amylase aktivitet) og oppkjøpet av løselig sukker som energikilde under deres patogene interaksjon med verten planter.
Alpha-amylase er kjent for å være kritisk i A. flavus virusets9,10,11, og betydningen av AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hemming/antigrowth)13, Vi generert transgene mais planter uttrykke Lablab AILP gen under konstituerende CaMV 35S arrangøren. Målet var å undersøke om heterologous uttrykk for denne α-amylase hemmer i mais er effektiv mot A. flavus patogenese og aflatoxin produksjon under mais kjernen infeksjon. Våre resultater viser at transgene mais kjerner uttrykke AILP betydelig redusert A. flavus vekst og aflatoxin produksjon under kjernen infeksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gi tap i jordbruksprodukter patogener og skadedyr er et globalt problem20. Foreløpig anvendelse av syntetiske soppmidler og plantevernmidler er dominerende kontroll plante-patogener og skadedyr, men gjenværende giftigheten av disse biokjemikalier i mat og feed kan utgjøre alvorlig trussel mot mennesker og dyr helse21. Den økonomiske betydningen av mais mat og fôr beskjære, reduksjon eller eliminasjon av aflatoxin forurensning er av største betydning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjelp i utviklingen og analysere transgene mais under tidlig generasjoner. Dette arbeidet mottok økonomisk støtte av USDA-ARS CRIS prosjektet 6054-42000-025-00D. Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det oss Department of Agriculture. USDA-ARS’ lik sysselsetting mulighet (EEO) mandater likestilling for alle personer og forbyr diskriminering i alle aspekter av byrået personell politikk, praksis og operasjoner.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
Referências
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
