Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Vecteurs viraux sont des outils biologiques importants qui peuvent introduire le matériel génétique dans les cellules afin de compenser les gènes défectueux, protéines de croissance important de réguler positivement ou fabriquer des protéines de marqueur qui mettent en valeur la structure et les connexions synaptiques de leurs cibles. Cet article se concentre sur l’injection directe d’un vecteur lentiviral marqués transportable très efficace dans la moelle épinière de rat afin de faire ressortir les grandes voies motrices avec traçage fluorescente.  Cette méthode est aussi très appropriée pour des études de régénération et repousse axonales d’introduire des protéines d’intérêt dans les diverses populations de neurones et a été utilisée pour faire taire les neurones pour cartographie fonctionnelle études^1,2.

Nombreux détails anatomiques des voies motrices la colonne vertébrale ont été élucidées par des études de l’injection directe à traceurs classiques tels que BDA et fluoro-or^{3,4,5,6,7 , 8}. ces traceurs sont considérées comme l’étalon-or mais peuvent avoir certains inconvénients tels que l’absorption par les axones endommagés, ou axones dans passage de la substance blanche entourant une injection site^9,10,11 . Cela pourrait conduire à des interprétations erronées de la connectivité de la voie et peut être un inconvénient dans les études de régénération où absorption du colorant par des axones endommagés ou dissociées pourrait être confondu avec pour régénérer les fibres au cours de l’analyse ultérieure¹².

Vecteurs lentiviraux sont populaires dans les études de thérapie génique, puisqu’elles fournissent une expression stable et à long terme dans les populations neuronales^{13,14,15,16,17,18 ,},¹⁹. Cependant, traditionnellement emballés vecteurs lentiviraux peut avoir limité transport rétrograde et peuvent déclencher la réponse du système immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo^4,20,,²¹. Un vecteur de transport rétrograde très efficace appelé HiRet a été produit par Kato et al. en modifiant l’enveloppe virale avec une glycoprotéine de virus de la rage pour créer un vecteur hybride qui améliore le transport rétrograde^22,23.

Traçage rétrograde introduit un vecteur dans l’espace synaptique d’un neurone cible, lui permettant d’être absorbés par l’axone de la cellule et transportés vers le corps cellulaire. Transport avec succès des HiRet a été démontrée de synapses neuronales dans le cerveau des souris et des primates^23,24 et du muscle dans les motoneurones²². Ce protocole montre l’injection dans la moelle lombaire, en ciblant spécifiquement les terminaux synaptiques de propriospinales interneurones et des neurones du tronc cérébral. PNs recevoir des connexions de plusieurs différentes voies spinales et peuvent donc être utilisés pour cibler une population diverse de neurones de la moelle épinière et du tronc cérébral. Neurones marqués dans cette étude représentent des circuits qui innervent les motoneurones piscines relatives à la fonction motrice du membre postérieur. Étiquetage robuste est vu dans la moelle épinière et le tronc cérébral, y compris des détails de haute fidélité de tonnelles dendritiques et terminaisons axonales. Nous avons aussi utilisé cette méthode dans les études précédentes au sein de la moelle épinière cervicale d’étiqueter propriospinales et tronc cérébral de voies réticulospinales²⁵.

Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière lombaire d’un rat. Comme on le voit dans le film 1, l’incision est ciblée en identifiant la vertèbre L1 située à la dernière côte. Cela est utilisé comme un point de repère caudale pour une incision de 3-4 cm qui expose la musculature sur la moelle épinière L1-L4. Laminectomies des aspects dorsales des vertèbres T11-T13 sont effectués et une aiguille de verre biseauté est réalisée 0,8 mm latéral de la ligne médiane et abaissé de 1,5 mm profondément dans la matière grise pour injecter le virus.