JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/59160
, , , ,
1Shriner’s Pediatric Research Center,Temple University

Summary

Dieses Protokoll zeigt Injektion von Doppelthebel transportable viralen Vektoren in Ratte Rückenmark Gewebe. Der Vektor wird an der Synapse aufgegriffen und zum Zellkörper von Neuronen Ziel transportiert. Dieses Modell eignet sich für retrograde Tracing wichtige spinalen Bahnen oder gezielt Zellen für Gen-Therapie-Anwendungen.

Abstract

Einführung der interessierenden Proteine in Zellen im Nervensystem ist schwierig wegen angeborenen biologischen Barrieren, die den Zugriff auf die meisten Moleküle beschränken. Injektion direkt ins Rückenmark Gewebe umgeht diese Barrieren, den Zugang zum Zellkörper oder Synapsen, wo Moleküle eingebaut werden können. Kombination von viralen Vektoren Technologie mit dieser Methode ermöglicht die Einführung von Zielgenen in Nervengewebe zum Zwecke der Gentherapie oder Trakt Ablaufverfolgung. Hier ist ein Virus entwickelt für hocheffiziente retrograder Transport (HiRet) an den Synapsen der Propriospinal Interneuronen (PNs) den spezifischen Verkehr zu Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm Kerne fördern eingeführt. PNs-Targeting nutzt die zahlreichen Verbindungen erhalten sie von motorischen Bahnen wie die Rubrospinal und Reticulospinal Flächen sowie deren Verschaltung untereinander im gesamten Rückenmarkssegmente. Repräsentative Ablaufverfolgung konstitutiv aktiv grün fluoreszierendes Protein (GFP) zeigt High Fidelity Details der Zellkörper, Axone und dendritischer Dorne in thorakalen PNs und Reticulospinal Neuronen in die pontine Formatio Bildung der HiRet Vektor mit. HiRet integriert in Hirnstamm Wege und PNs sondern zeigt Alter abhängigen Integration in kortikospinalen Trakts Neuronen. Zusammenfassend lässt sich sagen ist Rückenmark Injektion mittels virale Vektoren eine geeignete Methode für die Einführung der interessierenden Proteine in Nervenzellen gezielt Tracts.

Introduction

Virale Vektoren sind wichtige biologische Hilfsmittel, die genetisches Material in Zellen um defekte Gene, Upregulate wichtigen Wachstumsmärkten Proteine kompensieren oder fertigen Marker-Proteine, die die Struktur und die synaptischen Verbindungen von hervorheben einführen können Ihre Ziele. Dieser Artikel konzentriert sich auf direkte Einspritzung eines hocheffizienten Doppelthebel transportable Lentivirale Vektors ins Rückenmark Ratte um großen motorischen Bahnen mit fluoreszierenden Ablaufverfolgung zu unterstreichen.  Diese Methode eignet sich auch sehr für axonalen Regeneration und nachwachsen Studien zur Einführung von interessierender Proteine in unterschiedlichen Populationen von Neuronen und wurde verwendet, um Neuronen für funktionale Zuordnung Studien1,2zum Schweigen zu bringen.

Viele anatomische Details der spinalen motorischen Bahnen wurden aufgeklärt durch Direkteinspritzung Studien mit klassischen Tracer wie BDA und Fluoro-Gold3,4,5,6,7 , 8. diese Tracer gelten als Goldstandard aber können gewisse Nachteile wie Aufnahme durch beschädigte Axone oder Axone in Durchgang in der weißen Substanz umgibt eine Injektion Seite9,10,11 . Dies könnte zu Fehlinterpretationen der Weg Konnektivität und möglicherweise ein Nachteil in Regeneration Studien wo könnte Farbstoff Absorption durch beschädigte oder abgetrennten Axone verwechselt werden, für die Regeneration der Fasern während der späteren Analyse12.

Lentivirale Vektoren sind in Gentherapiestudien, beliebt, da sie stabile, langfristige Ausdruck in neuronalen Populationen13,14,15,16,17,18 bieten ,19. Jedoch traditionell verpackte Lentivirale Vektoren können haben begrenzte retrograden Transport und Reaktion des Immunsystems bei auslösen können in Vivo4,20,21. Ein hocheffizientes retrograder Transport Vektor bezeichnet HiRet wurde produziert von Kato Et Al. durch Ändern der Virushülle mit ein Tollwut-Virus Glykoprotein, einen Hybrid-Vektor erstellen, der retrograder Transport22,23verbessert.

Retrograde Ablaufverfolgung stellt einen Vektor in den synaptischen Raum eines Ziel-Neurons, so dass sie von dieser Zelle Axon aufgegriffen und zum Zellkörper transportiert werden. Erfolgreiche Transport von HiRet wurde von neuronalen Synapsen in die Gehirne von Mäusen und Primaten23,24 und vom Muskel in Motoneuronen22nachgewiesen. Dieses Protokoll zeigt die Injektion in die Lendenwirbelsäule Rückenmark, gezielt an den synaptischen Terminals Propriospinal Interneuronen und Hirnstamm Neuronen. PNs Empfangs-Verbindungen aus vielen verschiedenen spinalen Bahnen und können so genutzt werden, um gezielt eine vielfältige Bevölkerung von Nervenzellen im Rückenmark und Hirnstamm. Beschriftete Neuronen in dieser Studie stellen Schaltungen innervieren Motoneuron Pools in Bezug auf Megalosauridae Motorik. Robuste Kennzeichnung sieht in Rückenmark und Hirnstamm, einschließlich High Fidelity Details dendritischer Dorne und Axon Klemmen. Wir haben diese Methode auch in früheren Studien innerhalb des zervikalen Rückenmarks verwendet, um Propriospinal und Hirnstamm Reticulospinal Wege25beschriften.

Dieses Protokoll zeigt Injektion von viralen Vektoren in der Lendenwirbelsäule Rückenmark einer Ratte. Wie im Film 1, richtet sich der Schnitt durch die Identifizierung des L1-Wirbels befindet sich an der letzten Rippe. Dies dient als ein kaudalen Wahrzeichen für einen ca. 3-4 cm Schnitt, die Muskulatur über das Rückenmark L1-L4 verfügbar macht. Laminektomien der dorsalen Aspekte der Wirbel T11 T13 durchgeführt und eine abgeschrägte Glasnadel richtet sich 0,8 mm seitlich von der Mittellinie und 1,5 mm abgesenkt tief in der grauen Substanz, Virus zu injizieren.

Protocol

Alle folgenden chirurgischen und tierischen Versorgung Verfahren haben die Tier Pflege und Nutzung Ausschuss der Temple University gebilligt. 1. präoperative Vorbereitungen Bereiten Sie gezogenem Glas Nadeln für virale Injektion ein paar Tage vor der Operation mit 3,5 Nanoliter Kapillare Glaspipetten für Nanoliter Injektoren entwickelt. Ziehen Sie jede Pipette auf eine zweistufige Nadel Puller gemäß den Anweisungen des Herstellers, zwei Nadel Vorlagen zu erstellen. Ver…

Representative Results

Erfolgreiche Injektion und Transport von viralen Vektoren sollten Transduktion einer robusten Bevölkerung von einseitigen Nervenzellen im Rückenmark und in bestimmten Hirnstamm Kernen führen. Abbildung 1 zeigt Stereotype Etikettierung von Neuronen und Axonen im thorakalen Rückenmark und in die pontine Formatio Bildung der Hirnstamm bei vier Wochen nach der Injektion. GFP Ausdruck sieht in Neuronen in der grauen Substanz des thorakalen Rückenmarks auf der Seite ipsila…

Discussion

Genmanipulation von Neuronen im Gehirn und im Rückenmark hat Highlight sensorische, motorische und autonome Wege über fluoreszierende Tracing und nachwachsen Potenzial von neuronalen Traktaten nach Verletzungen27,28, gedient. 29 , 30 , 31 , 32 , 33. direkte Injektion von Doppelthebel trans…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall R01 R01NS103481 finanziert und die Shriners Hospital für die pädiatrische Forschung gewährt SHC 84051 und SHC 86000 und dem Department of Defense (SC140089).

Materials

#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley’s anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neurociência. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Tags

Lentiviral VectorSpinal CordMotor PathwaysViral VectorGenetic MaterialNeural CircuitsDirect InjectionL1 To L4 Spinal LevelsMicromanipulatorAnesthetized RatSkin IncisionSpinous ProcessesRat Tooth Forceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image