JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

העברת רטרוגרדית חלבונים מהמשטח תא גולג’י הוא חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס ממברנה. כאן, אנו מתארים שיטה לנתח מבחינה ביוכימית תא השטח-כדי-גולג’י הובלה של חומרים באמצעות functionalized nanobodies בתאים הלה.

Abstract

הובלה של חלבונים וממברנות מהמשטח תא גולג’י ומעבר חיוני הומאוסטזיס, זהות אברון, פיזיולוגיה. ללמוד תנועה רטרוגרדית חלבון, לאחרונה פיתחנו ערכת כלים מגוונים מבוססי nanobody לנתח תחבורה מהמשטח תא למתחם גולג’י, או על ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. אנחנו מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוק אנטי functionalized (GFP) nanobodies — חלבון קטן, monomeric, גבוהה-זיקה קלסרים — כי ניתן להחיל על שורות תאים לבטא קרום חלבונים עניין עם moiety-GFP חוץ-תאית. Nanobodies derivatized קשור הכתבים GFP במיוחד הם הפנימו והועברו קמח לאורך נתיבי המיון של הכתבים. Nanobodies היו functionalized עם fluorophores בצע תחבורה רטרוגרדית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ולחיות הדמיה, עם ascorbate peroxidase 2 (APEX2) לחקור לוקליזציה ultrastructural של מתחמי כתב-nanobody על ידי אלקטרון מיקרוסקופ, ועם טירוזין מוטיבים sulfation (TS) כדי להעריך קינטיקה של טרנס-גולג’י רשת (TGN) הגעה. במאמר מתודולוגי, אנחנו חלוקה לרמות ההליך כללי bacterially אקספרס ולטהר functionalized nanobodies. אנו מדגימים את השימוש כלי שלנו באמצעות את nanobodies mCherry – ו TS-השתנה כדי לנתח ספיגת endocytic ואת ההגעה TGN של חלבונים מטען רב עוצמה.

Introduction

תנועה רטרוגרדית של חלבונים ושומנים מפני השטח תא אל תאי תאיים שונים הוא קריטי עבור תחזוקה של הומאוסטזיס ממברנה לאזן את הפרשה, למחזר מרכיבי anterograde תחבורה machineries1 , 2. בעקבות הפנמה דרך אנדוציטוזה clathrin תלוית או – עצמאית, חלבונים, שומנים בדם מטען קודם לאכלס מוקדם endosomes מהיכן שהם נמצאים רחוק הופנה גם לאורך מערכת אנדו-lysosomal, ממוחזר כדי קרום פלזמה, . או יישוב לרשת הטרנס-גולג’י (TGN). מיחזור endosomes ו/או על פני התא כדי TGN זה חלק מהמחזוריות פונקציונלי של מספר anterograde מטען transmembrane רצפטורים, כגון הקטיון תלוית ועצמאי הקטיון מנוז-6-פוספט הקולטנים (CDMPR ו- CIMPR) אספקת לאחרונה מסונתז hydrolases lysosomal מ TGN endosomes מאחר lysosomes3,4,5, sortilin,6,SorLA7ושל Wntless (WLS) הובלת ונ ט ליגנדים השטח תא 8 , 9 , 10 , 11. לחלבונים אחרים לאחזר לחזור TGN TGN46 הינם שלו קשורים איזופורמים12,13,14, מלכודות (מסיס N– ethylmaleimide רגיש פיוז’ן גורם מצורף קולטנים) 15 , 16 , 17, קודמן עמילואיד חלבון (APP)18,19, ankylosis מתקדמת (תודה) חלבון20, מובילי מתכת כגון ATP7A/B או DMT121,22, ו transmembrane עיבוד אנזימים כולל קרבוקסיפפטידאז D, furin או BACE123,24,25. מלבד אלה חלבונים אנדוגני, רעלים בקטריאלי, צמח (למשל, טוקסין שיגה, כולרה, ריצין ו abrin) לחטוף machineries רטרוגרדית תחבורה כדי להגיע לחדר מיון לשם retrotranslocation לתוך ציטוזול26,27, 28,29.

על מנת לנתח ישירות רטרוגרדית התנועה, קודם לכן פיתחנו ערכת כלים מבוססי nanobody תווית ולעקוב אחר מטענים חלבונים מהמשטח תא תאיים תאים30. Nanobodies לייצג משפחה חדשה של קלסרים חלבון נגזר homodimeric כבד שרשרת-בלבד נוגדנים (hcAbs) המתרחשים באופן טבעי31,של גמליים ודגים סחוס-32. הם מהווים תחום שרשרת כבדה (VHH) משתנה של hcAbs ויש להם יתרונות רבים קונבנציונאלי נוגדנים (למשל, IgGs): הם monomeric, קטן (~ 15 kDa), מסיס מאוד, ללא, אגרות דיסולפידי יכול להיות מבוטא bacterially, ונבחר גבוהה-זיקה מחייבת33,34,35,36. כדי להפוך את כלי nanobody שלנו רב-תכליתי וישימים בקנה מידה נרחב, אנחנו מועסקים nanobodies נגד functionalized-GFP חלבונים פני תווית ולעקוב המתויגת GFP שלהם בתחום חוץ-תאית/lumenal. על ידי functionalization של nanobodies עם mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2) תחבורה רטרוגרדית37, או טירוזין sulfation (TS) רצפים, בוטרפליי מטען transmembrane חלבונים ניתן לנתח הכתיב קבוע ולחיות הדמיה תא, על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. מאז sulfation טירוזין מתווכת על-ידי sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 ו- TPST2) הוא שינוי posttranslational מוגבלת של הטרנס-גולג’י/TGN, ישירות שלומדים תחבורה, קינטיקה של חלבונים עניין מהמשטח התא הזה תאיים גולג’י תא38,39,40.

במאמר שיטות, נתאר את הקלות של ייצור של nanobodies functionalized (VHH-2xTS-APEX2, – mCherry נגזרים) מתאים עבור מספר יישומים כדי לנתח תחבורה רטרוגרדית תאים בתרבית של30. אנו מתמקדים בעיקר על השימוש של TS באתר-השתנה nanobody עבור ניתוח של התעבורה תאיים מהמשטח תא התא של sulfation.

Protocol

1. חיידקי טרנספורמציה עם Functionalized Nanobodies הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור הביטוי, טיהור, ניתוח של nanobodies נגד functionalized-GFP כפי שתואר לעיל30. Derivatization עם moieties חלבונים אחרים עשויים לדרוש שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי. להפשיר חיידקים chemocompetent (~ 100 µL) מתאים ביטוי חלב?…

Representative Results

לחקור חלבונים רטרוגרדית תחבורה ליעדים תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס-nanobody anti-GFP כדי תווית ובצע פיוז’ן רקומביננטי חלבונים מן השטח תא30. . הנה, נדגים לייצור חיידקים כגון derivatized nanobodies ומדגימים את היישום שלהם ללמוד ספיגת endocytic על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרו?…

Discussion

Nanobodies מייצג את שיעור המתעוררים של חלבון פיגומים קלסר עם יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונלי: הם קטנים, יציבה, monomeric, ניתן לבחור עבור דיסולפידי זיקה וחוסר גבוהה אג ח33,35, 44 , 45. הם משמשים במספר יישומים, כגון מערכות התרבו?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 31003A-162643 על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית. אנו מודים ניקול Beuret, את Biozentrum הדמיה הליבה מתקן (IMCF) לקבלת תמיכה.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer’s disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

NanobodyEndocytic UptakeRetrograde TransportTrans-Golgi NetworkCell Surface ReceptorsFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTyrosine Sulfation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image