Pez cebra (Danio rerio) se están convirtiendo en un modelo animal vertebrado usados para la colonización microbiana y la patogenesia. Este protocolo describe el uso del protozoo Paramecium caudatum como vehículo de infección transmitidas por los alimentos en las larvas de pez cebra. P. caudatum internaliza las bacterias y haz tomado por larval pez cebra a través el comportamiento natural de aprovecharme.
Debido a su transparencia, maleabilidad genética y facilidad de mantenimiento, el pez cebra (Danio rerio) se han convertido en un modelo vertebrado utilizado para enfermedades infecciosas. Pez cebra larvas alimentan naturalmente el protozoo unicelular Paramecium caudatum. Este protocolo describe el uso de p. caudatum como vehículo de infección transmitidas por los alimentos en el pez cebra larval. P. caudatum interiorizar una amplia gama de bacterias y células bacterianas permanecen viables por varias horas. Pez cebra entonces presa de p. caudatum, se libera la carga bacteriana en el foregut en digestión del vehículo paramecium y las bacterias colonizan el tracto intestinal. El protocolo incluye una descripción detallada del mantenimiento de paramecio, cargando con las bacterias, determinación de la degradación bacteriana y dosis, así como infección de pez cebra por alimentación con paramecio. La ventaja de utilizar este método de infección transmitidas por los alimentos es que estrechamente imita el modo de la infección observada en enfermedad humana, conduce a la colonización más robusta comparada con protocolos de inmersión y permite el estudio de una amplia gama de patógenos. Infección transmitidas por los alimentos en el modelo de pez cebra puede utilizarse para investigar la expresión del gen bacteriano dentro del anfitrión, interacciones huésped-patógeno y señas de identidad de patogenicidad como morbilidad, localización, difusión y carga bacteriana.
Cuota de pez cebra morfológicamente y funcionalmente conservado características con los mamíferos, incluyendo granulocytic linajes (p. ej., neutrófilos), monocito/macrófago-como las células, los receptores Toll-like, citoquinas proinflamatorias y péptidos antimicrobianos1 . El tracto intestinal en el pez cebra es completamente desarrollado en 6 días post fertilización (dpf) y muestra conservación morfológica y funcional con el tracto gastrointestinal de mamífero, como conservado regulación transcripcional en células epiteliales intestinales 2. lo pez cebra un excelente modelo de colonización microbiana intestinal y patogénesis. Una amplia gama de microbios entéricos se ha estudiado en el modelo de pez cebra, incluyendo enterohemorrágica Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, la pez cebra microbiota7,8y el papel de los probióticos en la inmunidad intestinal9. Una clara ventaja del modelo de pez cebra es que es colonizado por muchos microbios sin alterar la microbiota endógena, que permite la investigación del comportamiento microbiano en el contexto de poblaciones microbianas mezcladas3, 6. Actualmente, la mayoría modelos de pez cebra de colonización gastrointestinal y enfermedad dependen de la administración de los microbios por inmersión en baño, donde el pez cebra se incuban en una suspensión bacteriana para una cantidad específica de tiempo de10. Sin embargo, esto hace difícil determinar la dosis exacta de bacterias administradas y conduce a la colonización limitada con algunos microbios, particularmente con bacterias no patógenas. Alternativamente, se administra una suspensión bacteriana a pescar vía oral por sonda nasogástrica11, pero esto es técnicamente difícil y limitado a las larvas mayores y peces adultos.
Este protocolo describe el uso del protozoario unicelular Paramecium caudatum como vehículo de entrega transmitidas por los alimentos de microbios en el tracto gastrointestinal de las larvas de pez cebra. Paramecia es fáciles y baratos de mantener y es capaces de alimentarse de una gran variedad de microbios, incluyendo algas, hongos y bacterias, que interiorizan a través de un surco oral ciliadas12,13,14. Una vez interiorizado, las bacterias se encuentran en las vacuolas, que eventualmente acidificar y contenido son degradados en un marco de tiempo de varias horas15. Pez cebra larvas capturar paramecio como presas naturales pronto después de la eclosión, alrededor PD de 3 a 4 dependiendo de la temperatura16y asumir con eficacia alta. El proceso de captura de la presa tiene en promedio 1.2 s de detección para capturar17y paramecio capturado es digerido rápidamente en el foregut del pez cebra, que bacterias viables interiorizadas son liberadas en el tracto intestinal3. Como resultado, paramecio puede utilizarse como un método rápido y fácil para entregar una dosis alta y consistente de bacterias en el tracto gastrointestinal del pez cebra. La bacteria entregada puede transformarse ya sea para expresar una proteína fluorescente, como mCherry como se describe aquí, o, en el caso de bacterias genéticamente intratables, pueden ser previamente teñidos con un colorante fluorescente para permitir una visualización dentro de la tracto gastrointestinal.
Este protocolo describe la entrega de alimentos de enteropatógeno e. coli (enterohemorrágica e. coli [EHEC] y adherente invasoras de e. coli [AIEC]) y SSP. enterica de las salmonelas Typhimurium. Patógenas de e. coli y S. typhimurium son transmitidas vía la ruta fecal-oral18,19y pueden ser adquirida a través contaminado alimentos, como carne, verduras y productos lácteos. Utiliza como un vehículo de p. caudatum , e. coli y S. typhimurium colonizan con éxito las larvas de pez cebra dentro de 30 a 60 min de incubación conjunta con el vehículo de paramecium. La carga bacteriana alcanzada es suficientemente robusta como para visualizar la colonización y determinar carga de homogenados de tejido de la galjanoplastia.
El protocolo básico descrito aquí ha sido optimizado para patógenos de e. coliy ha sido exitosamente adaptado para otras especies bacterianas, incluyendo Salmonella enterica y Vibrio cholerae. Para algunas especies que no colonizan el intestino del pez cebra tras inmersión baño, incluyendo algunas cepas de Salmonella enterica y algunos anaerobios, infecciones transmitidas por los alimentos como se describe aquí pueden utilizarse para establecer con éxito la colonización. Comparado con el microgavage, que también se utiliza para establecer altas cargas bacterianas en el tracto intestinal larvas, infecciones transmitidas por los alimentos es técnicamente menos difíciles y requiere equipo menos especializado. Sin embargo, los parámetros críticos deben optimizarse para que la especie bacteriana y las cepas para ser utilizado. Tales factores incluyen la densidad bacteriana y paramecium para el paso de cocultivo de paramecio bacterias: si números bacterianos dentro paramecia son bajos, esto podría mejorarse mediante el aumento de la densidad bacteriana en el paso de la cultura. Algunas especies bacterianas pueden dañar al anfitrión paramecium, y esto debería ser evaluado por microscopía.
Otro factor importante en el presente Protocolo es presa de captura de pez cebra. La tasa de aprovecharme como se describe aquí se basa en la suposición de que cada captura presas huelga resultados en la ingestión de un paramecium. Altas densidades de paramecio por peces son utilizadas en el protocolo para asegurar altas tasas de aprovecharme. Sin embargo, captura de presa depende de la densidad de paramecio en el sistema, y en cultivos de paramecium muy diluida, depredando las tasas pueden ser tan bajas como paramecio de 13 a 15 por hora21,22. Una limitación es que las tasas de captura de presas también son fuertemente dependientes de las condiciones de iluminación y en la oscuridad, las tasas de captura son 80% más bajo que en condiciones de luz21 y esto deben tenerse en cuenta al establecer experimentos. Si tiempos de exposición a la presa tienen que ampliarse para optimizar la colonización, consideración ha de ser entregado a la exposición secundaria a bacterias a través de las heces. En las condiciones descritas arriba – 2 h de la exposición de la presa, esta exposición es insignificante, puesto que tiempo del paso intestinal de bacterias es más de 1 h y la concentración de bacterias en el vehículo es mucho mayor que en las heces. Sin embargo, si el tiempo de exposición de la presa se incrementa significativamente, esto puede convertirse en un factor importante.
Los controles adecuados deben incluirse en este protocolo, incluyendo colonización del pez cebra después de alimentar con paramecio que contiene no patógenas e. coli MG1655. Si se comparan varias cepas bacterianas por su capacidad para colonizar el host de pez cebra, es importante comprobar si su vida media en el paramecio es comparable. Las mutaciones bacterianas, los comprometer la integridad de la pared celular o la detección de ácido, incluidos pueden comprometer la estabilidad bacteriana dentro de paramecio. En tales casos, pez cebra de alimentación debe ser ajustada para tener en cuenta las diferencias en la dosificación.
El protocolo descrito aquí puede utilizarse para investigar la colonización bacteriana y sus consecuencias, incluyendo imágenes de colonización bacteriana del pez cebra como se describe anteriormente, así como mediante la determinación de UFC por pez cebra de homogeneizado de tejido3, o investigando la mortalidad y la morbilidad asociada a la infección. Idealmente, para la visualización de bacteria, se recomienda las cepas bacterianas que expresan proteínas fluorescentes como mCherry o proteína fluorescente roja (RFP). Esto permitirá que la visualización del crecimiento de las poblaciones bacterianas. Si la cepa bacteriana no es genéticamente manejable o el uso de la expresión de la proteína fluorescente está impedido por otras razones, las bacterias pueden teñirse con un colorante fluorescente, como FM 4-64FX, antes de cultura conjuntamente con el paramecio. Cuando se utiliza el protocolo descrito aquí, cocultivo con paramecio no disminuyen el brillo del tinte y bacterias teñidas son claramente visibles en el intestino del pez cebra. Sin embargo, el tinte se diluirá en el tiempo significativa proliferación bacteriana ocurre en el host de pez cebra. En cualquier caso, las bacterias fluorescentes rojo son preferibles sobre las bacterias verde fluorescente, desde tejido autofluorescencia puede ser superior en el verde que en el canal rojo.
Se ha encontrado que este protocolo puede ser adaptado para aerobios y microaerofílicos especies bacterianas. Es posible adaptarlo para la alimentación de las esporas y especies de hongos, aunque esto queda por probarse experimentalmente.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los miembros del grupo Krachler para la lectura crítica y comentarios del manuscrito. Este trabajo fue financiado por un UT sistemas STAR award, el BBSRC y el NIH (R01AI132354).
Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
hemocytometer or cell counter | any | ||
stereomicroscope | any | ||
table-top centrifuge | |||
microwave | |||
rotator wheel | |||
heated shaking incubator | |||
aquatics facilities | |||
breeding tanks |