固体支持、无蛋白质、双磷脂双层膜 (dlbm) 可转化为复杂的动态脂质纳米管网络, 可作为内质网的2d 自下而上模型。
提出了一种建立内质网 (er) 自下而上的结构细胞器模型的简便方法。该模型由高密度脂质纳米管组成, 从形态和动力学上看, 这些纳米管让人想起 er。这些网络来源于粘附在透明铝2o3 基板上的磷脂双双层膜贴片 。粘附是由环境缓冲液中的 ca2 +介导的。随后通过 bapta\ edta 对 ca2 +的消耗导致膜的收缩, 导致自发性脂质纳米管网络的形成。该方法仅包括磷脂和微加工表面, 用于简单地形成 er 模型, 不需要添加蛋白质或化学能 (例如, gtp 或 atp)。与细胞内质网的三维形态不同, 该模型是二维的 (尽管保持了纳米管尺寸、几何形状、结构和动力学)。这种独特的体外er 模型仅由少数成分组成, 易于构建, 并且可以在光镜下观察到。由此产生的结构可以进一步装饰, 以获得额外的功能, 例如添加与 er 相关的蛋白质或粒子, 以研究管内的传输现象。这里描述的人工网络是适合细胞 er 的结构模型, 其独特的特征形态已被证明与其生物功能有关, 而有关管域和重新安排内仍未完全了解。我们注意到, 这种方法使用铝2o3 薄膜涂层显微镜覆盖片, 这是在商业上可用, 但需要特殊的订单.因此, 最好能进入微制造设施进行制备。
er 在生物细胞中执行关键任务, 包括蛋白质折叠、脂质合成和钙调节1,2。er 形态是其执行的功能所固有的。它结合了平面堆栈和密度动态管域, 它们与细胞骨架不断相互作用, 并进行恒定的运动和重新排列。er 结构所经历的一些改造包括平面板和管之间的连续转变、从 er 腔形成或融合的囊泡形成、预先存在的管的伸长率、管的收缩、融合和断裂 3。管状网络的特殊结构在能量上是不利的。急诊室产生和维持这个组织的途径和机制, 以及这与它的职能之间的关系, 目前还没有完全了解4、5.
众所周知, er 在失去稳态时出现故障, 导致 er 应力, 这种情况是由蛋白质合成增加、错误折叠的蛋白质积累或 ca 2+的变化和氧化平衡引起的。er 应力反过来又会引起细胞器自然形态的变形, 特别是通过干扰网络组织6、7.作为响应, 单元格激活修复机制以返回到稳态状态。修复失败可导致 er 诱导的细胞凋亡, 这导致了几种代谢和退行性疾病, 如阿尔茨海默病、2型糖尿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等. 8。目前的研究重点是管状 er 网络的组织, 并有几项研究的重点是重组 er在体外2。一些现有的模型2,9,10需要蛋白质启动和维持膜曲率3,11, 并帮助细胞器达到其形状。显然, 非常需要反映 er 的一些关键结构和组织特征并提供高级实验研究的模型系统。
本文介绍了一种用于 er 的简便、无蛋白质/化学能量、动态体外模型的制备过程, 为研究 er 形态及相关功能提供了一个基本平台4。在这种方法中, er 模型是用一种自下而上的方法制造的, 它只使用少数元素, 在这种方法中, 感兴趣的分子可以集成, 以增加复杂性。网络代表 er 结构和动态。此外, 还可以观察到平面膜与管内的可逆转变、管内囊泡的形成、管的融合、滑动和收缩。除了作为不完全了解的细胞 er 的自下而上的模型外, 本协议中描述的通往纳米管网络的脂质路径还可适用于研究自组装、纳米流体、单分子和胶体的研究人员运输现象、马兰戈尼流和其他相关领域。我们方法中使用的唯一分子构建块是磷脂。该议定书几乎不需要实验室工作和基本设备, 可以纳入更多的要素。
在下面的讨论中, 描述了协议的关键步骤、可能的修改和限制。第一个关键步骤是观察室的正确组装, 因为 pdms 框架与铝2o3 表面的粘附本质上是弱的。在框架不能正确粘附在基板上的情况下, 内容将从观察室泄漏, 实验将停止。阻碍表面和框架适当密封的主要因素是: 1) 缺乏对 (重复使用的) pdms 框架和 2) 气泡的彻底清洁, 而这些气泡偶尔会被夹住在框架和基板之间。应使用新准备或彻底清洁的 pdms 框架。每次使用异丙醇之前和之后, 应冲洗框架, 然后用 di 水冲洗, 用氮气吹干。铝 2o3表面不需要任何事先清洁, 因为它们是在洁净室环境中制造的, 并保存在密封的容器中, 直到使用.由于铝2o3 的两性性质, 它不应该暴露在强酸性或基本的溶液中。根据单个设置的可访问性, 可以使用观测室的其他设计。这个室的重要特点是从打开的顶部自由地访问液体样品, 以及框架材料相对于使用的溶液和样品的惰性。箱体尺寸也是一个重要因素, 因为它们应容纳0.5 至1毫升的体积。由于所使用的表面通常是标准尺寸的盖板 (24 x 60 mm), 因此箱体的体积主要由框架的厚度决定。据我们所知, 具有能够容纳此协议中通常处理的样本卷的大小和深度的间隔在商业上是不可用的。因此, 我们在协议中专门用一个部分来详细说明样品室框架的制造和组装。
此协议中的另一个关键步骤是缓冲区交换。此步骤中的一个挑战是执行此交换所需的时间。mlv 在与铝2o3 基板接触时的传播是即时的, dlbm 的持续扩展导致其破裂, 终止实验 (图 2a, b)。因此, 应不断监测传播情况, 必须及时进行缓冲区交换。在初始化传播后, 不应过于快速地进行交换, 以使膜贴片达到最佳尺寸 (直径为 100-200μm)。另一方面, 表面的连续粘附会导致膜的高张力, 从而导致破裂。因此, 所有的膜贴片最终破裂, 如果扩散不中断。每个补丁的破裂时间不同, 因为这取决于 mlv 的大小和内部结构以及其中脂质的可及性。因此, 交换的时刻应安排在一个时间点, 在这个时间点上, 具有最佳大小的未破裂补丁代表了整个种群的大多数。缓冲区交换步骤中的另一个挑战是缓冲区的删除和添加率。过快进行这种替代会对最终的膜结构产生不利影响 (图 2c-e)。过度提取 ca2 +-hepes 缓冲液, 而不在基板上留下薄膜, 导致干燥和不可逆转的变形膜斑块 (图 2c)。即使在表面保持适量的液体, 突然添加螯合物 hepes 缓冲器也会导致膜结构的扰动。图 2d,e显示了水动力破坏膜斑块的典型外观。整体形态破坏不一定影响最终结构的动态特性 (即剩余区域的管状重组仍将发生)。然而, 在变形结构上, 观察物质的转变将变得困难。例如, 在图 2d中, 很难确定 dlbm 缩回的 mlv 方向。
该协议的一个可能的修改是所使用的脂质组合物。主要关注的焦点是在哺乳动物和酵母16 (例如)中主导 er 成分的磷脂。g. 磷脂酰胆碱 (pc)、磷脂酰乙醇胺 (pe) 和磷脂酰肌醇 (pi)。采用 pc 和 pi 混合物4进行了原实验。结果表明, 采用了 pc 和 dope 的混合和 pe 的衍生物。然而, 并不是所有的任意脂质成分已被发现创造通过该协议获得的管状结构。其他一些实验研究的脂质混合物涉及总心脏提取物, 大豆提取物极性,大肠杆菌提取物极性, pc 与硬耳骨-2-羟基-甘油-3-磷肌醇 (lyso-pi) 的混合物在不同的比例, 和混合物按不同比例计算的 pc-pe-pi-papfatidyl 丝氨酸 (ps)。由于管状膜结构具有较高的曲率, 需要单独的脂质分子的特殊排列, 因此所观察到的现象预计是脂质成分特异性的。
该协议中应用的另一个修改是表面制造方法。在这里, ald 被用来制造铝2o3 涂层盖板 。这与最初报告的沉积方法–反应溅射 4–不同。虽然这表明, 替代表面制造方法仍然可以导致像 er 样的管, 一个重要的限制似乎是表面材料的特异性。粘附的传播方式和强度在很大程度上取决于表面材料的性能, 这影响了静电相互作用、润湿性、疏水性和表面粗糙度等因素。al2o3 表面提供最佳的粘附强度, 脂膜既能紧密地附着在一起, 以作为双脂质双层膜传播, 又能在去除 ca2 +离子时分离形成管状网络.我们以前用 sio2 试验了类似的实验, 其中多层囊泡作为双脂双层膜扩散, 但在添加螯合剂17时没有观察到管状网络的形成。仅在铝2o3 或等离子体蚀刻铝18上观察到去连接和管的形成。我们的调查显示, 导致这种现象的促成参数是表面的 zeta 电位, 其中铝和 al 2o3 接近零 ( mv), sio2明显为负值。硼硅酸盐的 zeta 电位与 sio219 相似;因此, 脂质膜对硼硅酸盐的粘附同样强烈且不可逆。事实上, 多层脂质储层与硼硅酸盐表面的接触通常会导致单脂质双层的立即破裂和形成.本协议所需的 al 2o3 表面不容易或在商业上可用.但是, 它们可以从特种玻璃和基材制造商处定制订购。我们强烈建议您使用带薄膜制造设备的洁净室设施。
其他现有的自下而上的方法来制造像 er 样管状网络2,10涉及蛋白质以及化学能的输入 (例如, gtp 和 atp)。rapoport 和他的同事 2报告了在玻璃覆盖物上通过将 er 中存在的膜弯曲蛋白与磷脂和 gtp 混合在体外形成的 er 网络。bachand等人的作品.10显示了如何利用分子马达和 atp 作为能量源来创建这种动态管状网络。该协议不要求膜蛋白或有机化合物水解的能源。唯一必不可少的成分是固体基板和磷脂。不需要纯化和提取蛋白质。该协议在本构分子的简单性方面提供了最基本的 er 模型。
建立了这种基于口红的基本 er 模型后, 通过添加与 er 相关的组件来提高复杂性是令人感兴趣的, 因为它可以调查对系统的个别影响。与实际的 er 网络类似, 模型中的管是动态的。标记的膜蛋白 (或整个管状网络中的荧光颗粒) 的共轭和迁移可能会提供有关膜运动方向的信息。在转换过程中封装和监测 dlbm 和管内的荧光液体, 并可能对管内内容传输进行映射, 这可能是另一个焦点。最后, 通过对水凝胶体系结构中的网络封装, 可以从该协议产生的 2d er 模型向三维平滑 er 模型过渡。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢瑞典查尔莫斯技术大学的阿尔多·耶索卡教授对手稿的宝贵评论。这项工作是通过挪威研究理事会 (Forskningsrådet) 项目赠款274433提供的, uio: 生命科学融合环境, 瑞典研究理事会 (Vetenskapsrådet) 项目赠款 2015-04561,以及挪威分子医学中心 & 奥斯陆大学数学和自然科学系提供的启动资金。
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |