Summary

Количественное определение антител зависимых повышение Зика вируса в первичных клеток человека

Published: January 18, 2019
doi:

Summary

Мы описываем метод для оценки воздействия существующих иммунитет против вируса денге на Зика вирусной инфекции с помощью человеческой сыворотки, первичных клеток человека и инфекции количественной оценки количественных реального времени полимеразной цепной реакции.

Abstract

Недавнее появление flavivirus Зика и неврологических осложнений, таких как синдром Гийена-Барре и микроцефалия новорожденных, принесла серьезные общественной безопасности. Среди факторов риска повышение антитела зависимые (ADE) представляет самую серьезную угрозу, как недавнее возрождение Зика вируса (ZIKV) является главным образом в районах, где население подвергается и находится в состоянии предварительной иммунитета в других тесно связанных flaviviruses, особенно вирус денге (DENV). Здесь мы описываем протокол для количественной оценки воздействия человеческой сыворотке антител против DENV на ZIKV инфекции в первичных клеток человека или клеточных линий.

Introduction

Среди комаров-вирусных заболеваний Зика инфекции является одним из наиболее клинически важные1. Инфекции, вызванные flavivirus ZIKV, который, в большинстве случаев использует Aedes aegypti в качестве своей основной вектор1,2. Однако есть исследования, которые сообщили Aedes albopictus в качестве основного вектора в некоторых ZIKV вспышки3. Хотя инфекция протекает бессимптомно, во многих случаях, наиболее распространенными симптомами являются лихорадка, головная боль и мышечные боли2. Существует никакого лечения или вакцины для ZIKV инфекции и лечения доступны в основном благоприятной. Недавние вспышки ZIKV в Южной Америке привело к тяжелых случаев заболевания и увеличение приблизительно кратной неврологического расстройства в зародышах, названный микроцефалия2. Как Южная Америка является эндемиком несколько арбовирусов как вирус Западного Нила и DENV области, важно расследовать ли предварительного иммунитет к другим flavivirus(es) играет роль в тяжести ZIKV инфекций и болезней.

На протяжении веков вирусы развивались различные стратегии, чтобы увеличить свои шансы инфекционности для того, чтобы взять на себя принимающей ячейки машины и подавляющие противовирусное. Одним из наиболее интересных из всех является использование предварительно иммунных антител хост вирусами для повышения их репликации с явлением Аде4. ADE на всех четырех серотипы DENV был хорошо изученных и продемонстрировал увеличение вирусной титры и болезни результат5,6,7. В предыдущем исследовании в пробирке мы показали значительное повышение ZIKV репликации из-за существующих DENV иммунитета в первичной иммунные клетки человека8. Мы также продемонстрировали соответствующий метод в пробирке для количественной оценки существующих антител DENV возможность повышения ZIKV репликации в Главные ячейки.

Протокол, который мы разработали использует образцы сыворотки крови человека, которые тестируются для DENV обезвреживания в TCID-50 или assays налета сокращения нейтрализации тест (PRNT), наряду с ZIKV в биологически соответствующие клетки или клетки, полученные из тканей, которые могут заразить ZIKV.

Protocol

Образцы сыворотки, используемые в данном исследовании были получены от человека участников когорте из Колумбии. Сбор проб был одобрен внутреннего обзора Совет (IRB) в Universidad de Памплона (Колумбия, Южная Америка) и Лос Potios больница8. Образцы предоставляются анонимно и следовате…

Representative Results

На рисунке 1является пошаговое схематичных иллюстрацией всех шагов для выполнения протокола Аде. Это схема показаны всю процедуру Аде ZIKV из-за существующих иммунитет к DENV. Рисунок 2 показывает как человеческой сыворотки, образцы были р?…

Discussion

Перекрестной реактивности DENV антител, ведущих к Аде другие серотипы DENV препятствовало разработке эффективной вакцины против11. ZIKV принадлежит к той же семье, Флавивирусы и имеет значительную гомологию с другими flaviviruses, особенно DENV12. Основной целью нейтрализую…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была щедро поддержали 1R21AI129881-01 (до T.M.C.), начальное финансирование от национальных возникающих инфекционных заболеваний лабораторий и школы медицины Университета Бостона.

Materials

Fetal Bovine Serum  GEMINI 100-106
iCycler  BioRad 785BR02188 Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge Beckman Coulter  367160
Nanodrop-1000 Thermoscientific  1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit  Qiagen  204154 Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit  Qiagen  74106 Used for RNA extraction
RPMI-medium  Gibco 11875093

Referências

  1. Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
  2. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas–Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  4. Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
  5. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).
  6. Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).
  7. Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597 (2018).
  8. Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).
  9. Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18 (1), 534 (2017).
  10. Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650 (2015).
  11. McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).
  12. Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33 (2017).
  13. Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).
  14. Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).
  15. Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  16. George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7 (1), 10498 (2017).
  17. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, 2909-2914 (1990).
  18. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  19. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).
  20. Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
  21. Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7 (4), (2016).

Play Video

Citar este artigo
Asad, S., Feitosa-Suntheimer, F., Gold, A., Londono-Renteria, B., Colpitts, T. M. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (143), e58691, doi:10.3791/58691 (2019).

View Video