Een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van structurele en visuele uitlezingen bij knaagdieren door optische coherentie tomografie en optokinetic reactie wordt gepresenteerd. De resultaten bieden waardevolle inzichten voor oogcontrole, alsmede neurologische onderzoek.
Optische coherentie tomografie (OCT) is een techniek van het snel, niet-invasieve interferometrische waardoor hoge resolutie Retina imaging. Het is een ideaal hulpmiddel voor het onderzoek van de processen van neurodegeneratie, neuroprotectie en neuro-reparatie waarbij het visueel systeem, als deze vaak correlate goed met retinal wijzigingen. Als een functionele uitlezing, worden visueel evoked compenserende oog en hoofdbewegingen vaak gebruikt in experimentele modellen waarbij de visuele functie. Het combineren van beide technieken kan een kwantitatieve in-vivo-onderzoek van structuur en functie, die kan worden gebruikt om te onderzoeken van de pathologische condities of te beoordelen van het potentieel van nieuwe therapeutics. Een groot voordeel van de gepresenteerde technieken is de mogelijkheid voor het uitvoeren van de longitudinale analyses, waardoor het onderzoek van dynamische processen, vermindering van de variabiliteit en vermindert het aantal dieren die nodig zijn voor de experimenten. Het protocol beschreven is gericht op het bieden van een handleiding voor overname en analyse van de retinale scans van de hoge kwaliteit van muizen en ratten met behulp van een low-cost aangepaste houder met een optie om te leveren van respiratoire anesthesie. Bovendien, is de voorgestelde handleiding bedoeld als een educatieve handleiding voor onderzoekers met behulp van optokinetic response (OKR) analyse in knaagdieren, die aangepast aan hun specifieke behoeften en belangen worden kunnen.
Het onderzoek van het visuele traject, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, heeft bewezen een effectieve uitgangspunt bij de aanpak van niet alleen oogheelkundig1,2,3,4,5 , maar ook neurologische6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 vragen. In de afgelopen jaren, OCT en OKR zijn geïdentificeerd als nuttige analytische, niet-invasieve hulpmiddelen om te evalueren van een grote verscheidenheid aan retinopathies en netvlies manifestaties in verschillende knaagdieren modellen17,–18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT zorgt voor snelle en hoge resolutie in vivo visualisatie van het netvlies morfologie en structuur in muizen en ratten, met resultaten in goede overeenstemming met histologische secties van de dieren retinae26. OKR vormt een snelle en robuuste methode om visuele functie kwantitatief te evalueren.
Veel OCT apparaten toestaan gelijktijdige confocale scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) beeldbewerking met verschillende golflengten, waarin de diagnostische gegevens over de aandoeningen van het netvlies, dat wil zeggen, visualisatie van lipofuscin deposito’s of verbouwingen van het retinale pigment epitheel27. Bovendien is in vivo imaging van fluorescentie geëtiketteerd cellen in transgene dieren mogelijk28,29,30,31,32. De toepassing van OCT technologie in knaagdier modellen is echter nog steeds uitdagend, vooral vanwege de grootte van de kleine ogen. Verschillende commercieel beschikbare apparaten vereisen aanpassingen en vaak een ander papierformaat houder is vereist om het imago van de dieren van verschillende soorten. Dieren moeten bovendien anesthesie voor meting.
OKR apparaten kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de visuele functie bij knaagdieren. De dieren staan op een platform in het midden van een werkelijke of virtuele cilinder weergeven een bewegend raspend, die de dieren volgen met reflexieve kop en nek bewegingen. Deze optokinetic reactie is verminderd of geëlimineerd in het geval van de vermindering of verlies van visuele functie.
Het doel van dit protocol is te presenteren van een handleiding voor het meten van retinale dikte een commercieel beschikbare OCT-apparaat met een aangepaste houder verstrekken inhalant verdoving. Het protocol wordt geïllustreerd hoe om te analyseren volume scans met behulp van de software die wordt geleverd door de fabrikant. Voor het testen van de visuele, is het doel om aanwijzingen te geven over het gebruik van een commercieel beschikbaar systeem om te beoordelen van het OKR.
Dit protocol biedt een instructie voor de diktemetingen en het onderzoek van visuele functie bij knaagdieren. Visuele uitlezingen worden steeds vaker gebruikt in38,39,40 , translationeel onderzoek18,26,en zijn gemakkelijk overdraagbaar aan klinische proeven. Het grote voordeel van LGO ten opzichte van histologisch onderzoek in dierproeven zijn longitudinale analyses mogelijk waardoor het onderzoek van dynamische ziekteprocessen, grotendeels vermindering van de variabiliteit en het aantal dieren per studie nodig. Bovendien, in vivo imaging met OCT is niet onderworpen aan fixatie, snijden of kleuring van artefacten, die van invloed kunnen zijn op de laagdikte in histologische onderzoek.
De orthogonale richting de heldere laserstraal in alle vliegtuigen met betrekking tot het netvlies is echter een belangrijke stap om de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de waarden van de dikte. Het vereist enige training van de onderzoeker en is verplicht vóór de verwerving van OCT scans. Bovendien, als de commerciële apparaten zijn gebouwd voor toepassing op de mens, de kwaliteit van knaagdier OCT beelden nog inferieur is t.o.v. B-scans van de menselijke patiënten. In de auteurs de ervaring, het wellicht moeilijk te onderscheiden van de verschillende innerlijke retinal lagen (netvlies zenuw vezel laag, ganglion cellaag en Meervormige binnenlaag) tijdens de handmatige correctie. Wij raden daarom analyseren van deze lagen als een samengestelde uitlezing (IRL).
De experimentele opzet biedt een optie voor vluchtige anesthesie, bijvoorbeeld inhalant Isofluraan, die, in onze ervaring, veiliger en gemakkelijker te beheren dan injecteerbare anesthesie, bijvoorbeeld ketamine-xylazine41,42 en vermindert het risico op van vroeg ontwaken van knaagdieren in geval van langere overname keer (bijvoorbeeld bij het uitvoeren van beeldvorming van fluorescently geëtiketteerde cellen). In een voorstudie, werden volume scans geïdentificeerd als de protocollen met de hoogste validiteit en betrouwbaarheid. De Inter rater en test-hertest betrouwbaarheid was uitstekend wanneer volume scans met uitzondering van het centrale deel met de optische schijf werden beoordeeld met ICC (intra-class correlatiecoëfficiënt) waarden boven 0,85 voor alle evaluaties.
De meting van het optokinetic-antwoord is gebaseerd op de onvrijwillige optokinetic reflex, die in reactie op een voortdurend bewegende veld plaatsvindt. Bij knaagdieren, in tegenstelling tot andere soorten, houdt het verkeer niet alleen de ogen, maar het hele hoofd, die gemakkelijk kan worden opgespoord met behulp van de camera.
Onderscheidende tussen “volgen” of normale gedrags verplaatsingen van de dieren vergt enige training van de onderzoeker en het is belangrijk voor de experimentele groep verblinden. Bovendien, de dieren moeten een adaptie fase met de instelling van experimentele en gedurende lange tijd meting protocollen te vangen, de dieren moeten herhaaldelijk worden geanimeerd om te verzekeren dat “niet volgen” is als gevolg van het bereiken van de drempel OKR en niet te minderen aandacht. Er is ook een belangrijke stam variabiliteit met betrekking tot de visuele functie van laboratorium muizen en ratten43,44. De gezichtsscherpte van het knaagdier moet daarom worden beoordeeld voordat ze worden getest en sommige stammen, zoals SJL muizen, niet eens geschikt voor OKR metingen, zijn misschien zoals ze homozygoot voor het allel Pde6brd1 zijn (retina degeneratie 1).
Kortom, de behandeling van retinale morfologie en visuele functie in diermodellen voorziet in niet-invasieve, longitudinale onderzoek van structurele en functionele schade in het kader van EAE en nuttig kan zijn in andere modellen met betrekking tot de visuele systeem, met inbegrip van maar niet beperkt tot de modellen van retinopathies of letsel van de oogzenuw.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Dr. Robert Pfleger-Stichting Ilselore Luckow-Stichting, evenals Biogen en Novartis te PA. Figuur 1B was gereproduceerd vanaf “Whole-body positionele manipulatoren voor oogbeschadigingen en/of beeldvorming van verdoofde muizen en ratten: een do-it-yourself guide. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, PK., groen, A., Albrecht, P. BMJ Open oogheelkunde. 1, lid 1, e000008, 2017” met toestemming van BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |