Summary

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Published: December 14, 2018
doi:

Summary

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Abstract

Diferenciação e compromisso de célula eritroide proceder através da ativação de uma rede de linhagem restrita transcriptional orquestrada por um grupo de destino célula determinando e fatores de maturação. Estabelecemos anteriormente para definir um conjunto mínimo de factores necessários para instruir o desenvolvimento de células vermelhas do sangue, usando a linhagem direta reprogramação de fibroblastos em eritroide induzido progenitores/precursores (iEPs). Nós mostramos a superexpressão de Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) podem rapidamente converter murino e humano fibroblastos diretamente para iEPs que se assemelham a bona fide eritroide de células em termos de morfologia, fenótipo, e expressão gênica. Pretendemos que iEPs irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar o Regulamento de eritropoiese e célula de destino. Aqui descrevemos o processo gradual de conversão de fibroblastos de ponta de cauda murino em iEPs através da transcrição orientada por fator linhagem direta reprogramação (DLR). Neste exemplo, podemos realizar a reprogramação de fibroblastos de camundongos de linhagem traçagem eritroide que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) sob o controle do promotor eritropoietina receptor gene (EpoR), permitindo a visualização da célula eritroide indução de destino após reprogramação. Na sequência deste protocolo, os fibroblastos podem ser reprogramados em iEPs dentro de cinco a oito dias.

Enquanto melhorias ainda podem ser feitas para o processo, nós mostramos que mediada por GTLM reprogramação é um processo rápido e directo, produzindo células com propriedades de bona fide células progenitoras e precursor de eritroide.

Introduction

Glóbulos vermelhos (hemácias) são essenciais em todos os vertebrados e somam 84% de todas as células do corpo humano1. De embrionário para a vida adulta, nossa saúde é altamente dependente de regulação exata da homeostase de RBC. A produção contínua de hemácias maduras durante todo o desenvolvimento na idade adulta é conhecida como eritropoiese. Um grande desafio na pesquisa de eritropoiese é definir os mestre reguladores que coordene o desenvolvimento de RBC e o interruptor entre eritropoiese primitivo e definitivo. Reprogramação de linhagem direta dos progenitores eritroide apresenta uma oportunidade de entender melhor eritroide desenvolvimento em vivo.

Linhagem direta reprogramação (DLR), também conhecido como transdiferenciação celular, é o processo de reprogramação de um tipo de célula diretamente em outro, ignorando pluripotentes e multipotentes progenitoras estágios. DLR até agora tem sido usado para produzir vários tipos de células, incluindo neural2e nefrótica7, células progenitoras hematopoiéticas3,4,5, hepática6 . Para os biólogos do desenvolvimento, DLR tornou-se uma ferramenta importante para interrogar os aspectos de compromisso linhagem e processos de diferenciação terminal8,9. DLR pode complementar e substituir parcialmente na vivo estudos para mecanismos de compreensão do destino célula fatores determinantes durante o desenvolvimento. O protocolo DLR para reprogramação de progenitores eritroide descritos neste artigo fornece o campo um método complementar para estudos do desenvolvimento da eritropoiese.

Nós demonstramos anteriormente que a superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente de progenitores eritroide induzida (iEPs) 10. the GTLM-reprogramado eritroide células assemelham-se grandemente bona fide eritroide primitivo progenitores em termos de morfologia, fenótipo e gene expressão10. Assim iEPs tem limitada capacidade de proliferação e amadurecer-se hemácias nucleadas similares àqueles produzidos transitoriamente no embrião precoce antes do início da eritropoiese definitivo. Fazendo alterações nas condições de reprogramação (por exemplo, mutações pontuais em reprogramação fatores ou adição de outros factores), pode-se entender como isso leva a alterações no desenvolvimento eritroide e diferenciação. Por exemplo mostramos que a adição de Klf1 ou Myb ao coquetel GTLM altera o padrão de expressão de globina de predominantemente embrionário (primitivo) para principalmente adultos (definitivo). Esta constatação corrobora a validade do uso de DLR como uma ferramenta para a definição de fatores do desenvolvimento na eritropoiese.

Aqui, podemos descrever o processo de geração iEPs de fibroblastos de ponta de cauda de rato (TTF). Em nossos resultados representativos, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor– Cre R26– eYFP) que expressam a proteína fluorescente amarela (eYFP) do locus Rosa26 em todas as células que expressaram o receptor de eritropoetina, permitindo a fácil visualização do compromisso com a linhagem eritroide. Usando esse método, YFP positivo (EpoR +) células estão presentes logo em cinco dias depois de transdução. Este protocolo, portanto, oferece uma técnica rápida e robusta para a geração de eritroide progenitores em vitro.

Protocol

1. estabelecimento e manutenção da cauda do rato principal dica culturas de fibroblastos Prepare pratos de gelatina-revestido (recomendo um prato de 10 cm para uma cauda), cobrindo a superfície com 0.1% de gelatina e incubando os pratos por aproximadamente 20 min a 37 ° C. Aspirar a solução de gelatina do prato e deixe-o secar pelo menos 2 h. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Retire o rabo com uma tesoura, corte na base da cauda. Coloque o rabo no fosfato salino de Dulbecco (DPBS) c…

Representative Results

Aqui nós apresentamos um protocolo pode ser reproduzido para a produção de iEPs de fibroblastos adultos usando DLR orientado para a fator de transcrição. Avaliamos que a reprogramação de células usando citometria de fluxo, formadoras ensaios e gene análise da expressão. Para auxiliar a visualização da conversão ao destino de célula eritroide, realizamos a reprogramação de fibroblastos dos ratos da linhagem de rastreamento eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) q…

Discussion

Superexpressão de um cocktail de quatro fatores, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), é suficiente para reprogramar os fibroblastos murino e humanos diretamente ao iEPs10. As células reprogramadas eritroide assemelhava-se muito bona fide eritroide progenitores em termos de morfologia, fenótipo, expressão gênica e formadoras de capacidade. Esta constatação corrobora o raciocínio d…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonagem e Harvey Lodish (Instituto Whitehead) fornecendo muitos o plasmídeo utilizado para gerar a biblioteca retroviral. Agradecemos leiliane Siva e Sofie Singbrant (departamento de Medicina Molecular e Gene Therapy, Universidade de Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (departamento de Hematologia Molecular, Universidade de Lund) para os seus papéis na descrição da produção do iEP. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, parque de pesquisa biomédica de Barcelona), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, Nova Iorque), Carl Walkley (Instituto de pesquisa médica de St. Vincent e Departamento de medicina, Hospital de St. Vincent, Universidade de Melbourne), Ángel Raya (instituição catalã de investigação e estudos avançados, Barcelona) e G. de Vijay Sankaran (Broad Institute do Instituto de Massachusetts de tecnologia e Harvard, Cambridge ) por suas contribuições anteriores a este trabalho. Este trabalho foi financiado pela Fundação Ragnar Söderberg (a J.F.); o sueco de pesquisa Conselho (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (para J.F.); a Fundação sueca para a investigação estratégica (para J.F.); Fundação de Åke Wiberg (para J.F.); um subsídio de integração de Marie Curie (para J.F.).

Materials

DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

Referências

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Citar este artigo
Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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