Summary

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

Published: November 08, 2018
doi:

Summary

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

Abstract

Microdialysis은 동작 또는 병리학 (예를 들어, 발작의 특정 결과와 뇌 틈새 공간으로 확산 하는 신경학 활성 물질의 변화를 상관 관계가 확고 신경 과학 기법 대 한 간 질). 간 질을 공부, microdialysis 기술 단기 또는 장기 심지어 비디오-electroencephalography (뇌 파) 자발적인 발작 빈도, 심각도, 진행 및 클러스터링을 평가 하기 위해 모니터링 종종 결합 됩니다. 결합 된 microdialysis 뇌 파 여러 메서드 및 악기의 사용을 기반으로 합니다. 여기, 우리가 쥐 모델에서 간 질의 자연 역사의 여러 단계에서 시간이 지남에 모니터 조미료와 aspartate 유출 녹음 지속적 비디오 뇌 파 vivo에서 microdialysis를 수행. 결합 된 이렇게 페어링 신경 전달 물질 방출에 변화 질병 개발 및 진행의 특정 단계를 수 있습니다. Dialysate는 아미노산 농도 액체 크로마토그래피에 의해 결정 되었다. 여기, 우리가 설명 방법 및 개요 주 예방 조치 한 비보에 microdialysis 동안 해야한다-stereotaxic 수술에 특히 주의 microdialysis, 깊이 중 기저 및 높은 칼륨 자극 뇌 파 전극 뇌 파 기록 및 aspartate 및 조미료는 dialysate에 고성능 액체 크로마토그래피 분석. 이 방법을 적용할 수 있습니다 aspartate 및 두뇌에 조미료의 생리 적 농도의 변화를 유도 하는 약물 이나 질병의 다양 한 테스트. 적절 한 분석 분석 결과의 여부에 따라 그것은 사용할 수 있습니다 더 이상 뇌 파 기록을 동시에 채용 하는 경우 다른 수용 성 분자를 테스트 하.

Introduction

기능 장애 조미료-중재 흥분 성의 GABAergic 금지 neurotransmission 측 두 엽 간 질 (TLE)에 자발적인 발작의 결과에 대 한 통찰력을 제공 하려면 우리는 체계적으로 extracellular 농도의 모니터링 GABA1 와 나중 자연 질병의 다양 한 시간 포인트에서 쥐의 복 부 해 마에 있는 microdialysis에 의해 조미료와 aspartate2 수준 과정, , 개발 및 간 질의 진행 하는 동안. 우리는 TLE pilocarpine 모델 쥐, 모방 행동, electrophysiological 및 histopathological 변경3,4 면에서 매우 정확 하 게 질병을 이용 했다 그리고 우리 상관의 아미노 dialysate 농도 그것의 다른 단계에 산: epileptogenic 모욕, 대기 시간 단계, 첫 번째 자발적인 발작과 만성 phass5,,67시간 후 급성 단계. 질병 단계 프레임 장기 비디오-뇌 파 모니터링 및 정확한 뇌 파 및 자발적인 발작의 임상 특성에 의해 활성화 되었습니다. Microdialysis 기술에의 응용 프로그램은 장기 비디오-뇌 파 모니터링 TLE neuropathology에 대 한 기계적 가설을 제안 하 연관. 요약 하자면,이 원고에 설명 된 기술을 neurochemical 변경 개발 및 간 질 동물 모델에서의 진행으로 정의 된 뇌 영역 내에서 쌍 수 있습니다.

이점된 장치, microdialysis 정에 juxtaposed 깊이 전극의 구성 종종 간 질 연구 연구 신경 활동에 신경 전달 물질, 그들의 대사 산물, 또는 에너지 기질 변화 한다 상관 하는 어디에서 채택 된다. 대부분의 경우 그것은 자유롭게 행동 하는 동물에서 사용 하지만 그것은 또한 예를 들어, 수술8전에 깊이 전극 조사 수립이 저항 간 질 환자에서 인간의 비슷한 방식으로 지휘 될 수 있다. 뇌 파 기록 및 dialysate 컬렉션은 별도로 수행할 수 있습니다 (예를 들어를 한 반구에는 microdialysis 전극 이식도 수행 하는 동안 동물의 한 그룹에는 microdialysis을 수행 또는 다른 반구에 프로브 유일한 뇌 파 동물의 또 다른 그룹에). 그러나, 프로브를 전극 커플링 여러 장점을 있습니다: stereotaxic 수술을 간소화, 한 반구 조직 손상을 제한 (다른 하면서 조직학 연구에 대 한 제어로 그대로), 그리고이 결과 homogenizes 같은 뇌 영역 고 같은 동물에서 얻을 수 있습니다.

다른 한편으로, 그것은 집에서 만든 경우 기술 및 시간 결합 된 microdialysis 프로브 전극 장치 준비 해야 합니다. 하나는 시장에서 구입한 경우 상대적으로 높은 금액을 보낼 수 있습니다. 또한 때 microdialysis 프로브 (프로브 팁 직경 및 길이가 7-12 mm에서 200-400 µ m는 일반적으로)9및 EEG 전극 (전극 팁은 일반적으로 300-500 µ m의 직경, 및 충분히 관심10의 뇌 구조에 도달) 결합 하 여, 탑재 된 장치는 동물을 위해 번잡 하 고 특히 연결 하면 투 석 펌프 및 하드 와이어 EEG 레코딩 시스템 손실 될 경향이 머리의 한쪽에 크고 상대적으로 무거운 개체를 나타냅니다. 이 측면은 처리 하기 어렵고 덜 microdialysis 세션에 적응형 간 질 동물에 더 적합 합니다. 적절 한 수술 기법 및 적절 한 수술 치료는 최소한의 동물 불편을 일으키는 원인이 되 고 조합 microdialysis-뇌 파 실험10,11, 에 대 한 추구 되어야 오랫동안 임 플 란 트에 발생할 수 있습니다 12.

장점과 한계 microdialysis 기술의 세부 사항에 많은 신경 과학자에 의해 평가 되었습니다. 그것의 주요 장점은 다른 비보에 관류 기법 (예를 들어, 빠른 흐름 푸시 풀 또는 대뇌 피 질의 컵 관류)에 프로브는 관심13,14, 비교적 정확한 면적의 작은 직경 15. 둘째, microdialysis 막 조직과 perfusate; 사이의 물리적 장벽을 만듭니다. 따라서, 높은 분자 무게 물질 교차 하지 않는다 고 분석16,17방해 하지 않습니다. 또한, 조직 perfusate18의 난 류 흐름에서 보호 됩니다. 다른 중요 한 장점은 perfusate에서 분석 농도 극대화 하기 위한 perfusate 흐름 수정 가능성 (, microdialysis 과정 잘 수학적으로 정의 될 수 있습니다와 높이를 수정할 수 있습니다 샘플에 있는 분석의 농도)19. 마지막으로, 관심의 조직에 약물 또는 약리학 내용물을 고취 하 고 개입20의 사이트에 그들의 효과 결정 하는 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 한편으로, microdialysis는 전기 화학 또는 생물 센서;에 비해 제한 된 해상도 시간이 (일반적으로 이상 샘플 수집에 필요한 시간이 1 분) 그것은 조직 손상; 하는 침략 적 기법 그것은 관심의 실정이 함께 perfusate를 입력 하는 모든 녹는 물질의 지속적인 농도 기온 변화도 때문에 막 주위 공간 내에서 neurochemical 균형 타협. 마지막으로, microdialysis 기술은 높은 분석 기법에는 perfusate9,,2122,23 물질의 정량화에 대 한 고용의 제한에 의해 영향을 . 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 후 조미료와 aspartate 생물 샘플 분석에 대 한 orthophthaldialdehyde와 derivatization 잘 검증된24,,2526 , 27 그리고 그것의 광범위 한 토론이이 원고의 범위 이지만이 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터를 자세히 설명 합니다.

제대로 하 고 perfusate 구성의 수정 없이 수행, microdialysis 신경 전달 물질 방출의 기초 수준에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공할 수 있습니다. 기초 수준의 가장 큰 부분이 가능성이9시 냅 스 송신기 넘침의 결과 이다. 많은 경우에 추가 시 냅 스 공간에서 신경 전달 물질의 간단한 샘플링은 조사 목표를 추구 하기에 충분 하지, 때문에 microdialysis 기술을 채택 될 수 있다 또한 뉴런을 자극 하거나 중요 한의 그들을 박탈 하는 것은 K+ 또는 캘리포니아2 +연상 하거나 신경 전달 물질의 방출을 방지 등 생리 이온.

높은 K+ 자극 깨어 동물 뿐만 아니라 기본 및 organotypic 문화에 신경 활동을 자극 하는 신경 생물학에 종종 사용 됩니다. K+ (40-100 m m)의 높은 농도 가진 솔루션 건강 한 중추의 노출 신경 전달 물질28의 경과 끝. 간 질 동물1 과 다른 신경 퇴행 성 질환29,30높은 K+ 에 추가 릴리스를 제공 하는 뉴런의이 능력을 손상 될 수 있습니다. 마찬가지로, 캘리포니아2 + 부족 (Ca2 + 무료 솔루션 perfusing에 의해 얻은) 칼슘 의존을 설정 하는 데는 microdialysis에 의해 측정 하는 대부분 신경 전달 물질의 릴리스. 반면 캘리포니아2 + 독립적인 자료 명과에서 유래 하지만 많은 연구 캘리포니아2 +의 의미 논란 제기 Ca2 + 종속 릴리스 신경 원산지는 일반적으로 믿어진다-민감한 측정의 예 조미료 또는 GABA9: 따라서, 만약에 가능 하다 면, 그것은이 후자는 더 높은 공간적 해상도 전극 시 냅 스31에 가까이 있게 microsensor 연구, microdialysis 연구를 지 원하는 것이 좋습니다.

간 질 동물에 microdialysis 연구에 대 한 그들의 대부분에서 얻은 데이터는 비디오 또는 비디오-뇌 파 모니터링 발작, , 표지판 때문에 비정상적인 증상의 일시적 발생의 의존을 강조 하는 것이 중요 하다 과도 한 또는 동기 신경 활동 두뇌32에서. Pilocarpine 치료 동물 실험을 준비할 때 고려해 야 하는 electrographic 발작의 몇 가지 특성을 확인 하 고 있습니다. 자발적인 발작 뒤에 자주 뇌 파 interictal 스파이크3 우울된 활동 하 고 클러스터33,34에서 발생. 가짜 운영된 비 간 질 동물 발작 같은 활동35 전시 수 있습니다 따라서 뇌 파 기록 평가 대 한 매개 변수는 표준된36 여야 고, 만약에 가능 하다 면, microdialysis 세션의 타이밍 잘 정의 되어야 합니다. 마지막으로, 우리는 매우 좋습니다 전문가의 국제 리그 간 질 반대와 미국 간 질 학회 그들의 아주 최근 보고서37에 의해 제시 된 원리와 방법론 표준 비디오-뇌 파 모니터링 제어 성인 설치류에 대 한 ,38.

여기, 우리 microdialysis 조미료 및 간 질 동물에서 장기 비디오-뇌 파 기록 및 그들의 분석에서 dialysate HPLC에 의해 동시에 aspartate의 설명. 우리 하나 최상의 결과 위해 처리 해야 하는 프로토콜의 중요 한 단계를 강조 합니다.

Protocol

페라라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해와 이탈리아 보건부에 의해 모든 실험 절차 승인 (승인: D.M. 246/2012-B) 유럽 공동체에 설명 된 지침에 따라 1986 년 11 월 24 일 (86/609/EEC)의 위원회 지시문입니다. 이 프로토콜은 특히 쥐 뇌 dialysates microdialysis 세션 간 질 및 간 질 비 쥐의 뇌 파 제어에서 얻은에 조미료와 aspartate 결정에 대 한 조정 됩니다. 여기는 자료의 많은 수 있습니다 쉽게 대체 ?…

Representative Results

프로브 복구 평균 복구 (즉, 유리병 솔루션의 동일 볼륨에 콘텐츠의 perfusate에 평균 아미노산 콘텐츠) 되었고 2 μ/min와 조미료 3 μ/분 6.32 ± 0.64의 유량에서 15.49 ± 0.42 .89 ± 0.36 %2의 흐름 율에 Μ/분 고 10.13 ± 0.51 aspartate cuprophane 막 프로브를 사용 하는 경우에 대 한 3 μ/분. 평균 복구 조미료 3 μ/분 6.55 ± 1.07의 2 μ/min 흐름 ?…

Discussion

이 작품에서는, 우리는 TLE의 실험 모델에서 연속 비디오-뇌 파 기록 microdialysis와 결합을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 비디오-뇌 파 기록 기법 올바르게 다른 동물에 있는 질병의 진행 단계를 진단 하는 데 사용 됩니다 및 microdialysis 기술 (변경 되었습니다 발견에 대 한 시간에 발생 하는 조미료 릴리스의 변경 사항을 설명 하는 이전에 게시 연구2에 aspartate). 좋습니다는 단일 장?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 안 나 Binaschi, 파올로 Roncon 우선 출판 원고에 그들의 공헌에 대 한 엘 레 노어 팔 마를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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