Микродиализом возбуждающих аминокислот во время записи ЭЭГ в свободно перемещающихся крысы

Чтобы обеспечить понимание функциональных обесценение глутамат опосредованной возбуждающих и ГАМК ингибирующее синапсах, что приводит к спонтанной изъятий в височной эпилепсии (TLE), мы систематически контролироваться внеклеточной концентрации ГАМК¹ и позже уровнях глутамата и аспартат² микродиализом брюшной гиппокампа крысы в различное время естественной болезни курса, т.е., во время развития и прогрессирования эпилепсии. Мы воспользовались TLE пилокарпин модели крыс, которая имитирует болезни очень точно с точки зрения поведения, электрофизиологических и гистопатологические изменения^3,4 и мы коррелированных диализате концентрацию аминокислот кислоты на его различных этапах: острой фазы после эпилептогенных оскорбление, задержка фазы, время первой спонтанной захват и хронический phass^5,6,7. Обрамление фазы заболевания был включен в долгосрочный видео ЭЭГ-мониторинг и точные ЭЭГ и клиническая характеристика спонтанные судороги. Применение методики микродиализом, связанные с долгосрочной видео ЭЭГ-мониторинг позволил нам предложить механистический гипотезы для TLE невропатологии. Таким образом метод, описанный в этой рукописи позволяет сопряжения нейрохимических изменений в области определенных мозга с развития и прогрессирования эпилепсии в животной модели.

Спаренных устройств, состоящий из глубины электрода, сопоставленные к микродиализом канюлю, часто используются в научных исследований эпилепсии, где изменения нейротрансмиттеров, их метаболитов или энергетических субстратов должна быть соотнесена активности нейронов. В подавляющем большинстве случаев он используется в свободно поведение животных, но он может также проводиться в Аналогичным образом людьми, например, в Фармако стойкие эпилептические больных, перенесших глубина электрода расследование до хирургии⁸. Как запись ЭЭГ, так и диализате коллекция может быть выполнена отдельно (например, имплантировать электроды в одном полушарии и микродиализом зонда в другом полушарии или даже выполнение микродиализом в одной группе животных во время выполнения единственной ЭЭГ в другой группе животных). Однако, сцепка электроды зондов может иметь несколько преимуществ: Это упрощает стереотаксической хирургии, ограничивает повреждения тканей только одно полушарие (с другой стороны, оставляя нетронутыми, как элемент управления для гистологического исследования) и homogenizes результаты как эти получены из того же региона мозга и то же самое животное.

С другой стороны подготовка спаренных микродиализом зонд электрод устройства требует навыков и время если это домашнее. Один может потратить относительно большие суммы денег, если приобретен на рынке. Кроме того, когда микродиализом зонды (пробники, как правило 200-400 мкм в диаметре и длиной 7-12 мм)⁹и ЭЭГ электродов (электродов советы, как правило, 300-500 мкм в диаметре и достаточно долго, чтобы достичь структуры мозга интерес¹⁰) в сочетании, навесные устройства представляет объект относительно тяжелые и громоздкие на одной стороне головы, которая является неприятной для животных и склонны быть потеряно, особенно когда он подключен к диализа насос и система записи ЭЭГ-проволоки. Этот аспект является более актуальным в эпилептические животных, которые трудно справиться и менее адаптивный микродиализом сессий. Надлежащих хирургических методов и соответствующих послеоперационный уход может привести длительное имплантатов, которые вызывают минимальный дискомфорт животных и должно осуществляться для комбинаторной микродиализом ЭЭГ экспериментов^{10,11, 12}.

В деталях были рассмотрены преимущества и ограничения метода микродиализом многие неврологи. Его основное преимущество над другими в vivo перфузии методов (например, быстрый поток двухтактный или корковые Кубок перфузии) является небольшой диаметр зонда, которая охватывает относительно точной области интереса^{13,14, 15}. Во-вторых микродиализом мембрана создает физический барьер между ткани и perfusate; Таким образом высокомолекулярный вес вещества не пересекаются и не мешают анализу^16,17. Кроме того ткань защищен от турбулентного потока perfusate¹⁸. Другим важным преимуществом является возможность изменить поток perfusate для максимальной концентрации аналита в perfusate (т.е., процесс микродиализом может быть также определена математически и может быть изменен приносить высоко концентрации аналита в образце)¹⁹. Наконец метод может использоваться на настаиваться наркотиков или фармакологически активных веществ в ткани интерес и определить их воздействие на сайте вмешательства²⁰. С другой стороны микродиализом имеет ограниченное разрешение время (обычно более 1 мин из-за времени, необходимого для сбора проб) по сравнению с электрохимическими или биологические датчики; это инвазивный метод, который вызывает повреждение тканей; это компрометирует нейрохимических баланс в пространстве вокруг мембраны из-за непрерывного градиент концентрации всех растворимых веществ который входит perfusate вместе с аналита интерес. Наконец метод микродиализом во многом зависит от ограничений аналитических методов, используемых для количественной оценки веществ в perfusate^9,21,22,23 . Высокая производительность жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после деривации с orthophthaldialdehyde для анализа глутамата и аспартат в биологических образцах был хорошо проверенных^{24,25,26 , 27} и его широкое обсуждение выходит за рамки этой рукописи, однако данные, полученные с помощью этого метода будут описаны подробно.

При выполнении должным образом и без изменений состава perfusate, микродиализом может обеспечить надежную информацию о базальный уровень нейромедиатора релиз. Самая большая часть базальных уровней скорее всего является результатом распространения передатчика от синапсы⁹. Потому, что во многих случаях простой выборки нейромедиатора в загородный синаптического пространства не является достаточным для достижения целей расследования, метод микродиализом также могут быть использованы для стимулирования нейронов или лишить их важных физиологические ионов K⁺ или Ca^{2 +}, для того чтобы вызвать или предотвратить освобождение нейромедиатора.

Высокий K⁺ стимуляция часто используется в нейробиологии стимулировать активность нейронов не только спать животных, но и в начальных и organotypic культур. Экспозиции здоровой центральной нервной системы для решения с высокой концентрацией K⁺ (40-100 мм) вызывает измеряем нейротрансмиттеров²⁸. Эта способность нейронов для предоставления дополнительного выпуска в ответ на высокий K⁺ может быть нарушена в эпилептические животных¹ и в других нейродегенеративных заболеваний^29,30. Аналогично Ca^{2 +} лишения (получено perfusing Ca^{2 +} бесплатные решения) используется для установления кальций зависимых выпуск большинства нейротрансмиттеров, измеряется микродиализом. Считается, что Ca^{2 +} зависимых релиз является нейрональных происхождения, тогда как Ca^{2 +} независимого релиза исходит от глии, но многие исследования подняли споры над смыслью Ca^{2 +}-чувствительных измерения например глутамата или ГАМК⁹: таким образом, если это возможно, рекомендуется для поддержки микродиализом исследования с микропроцессоров исследований, поскольку эти последние имеют более высоким пространственным разрешением и электродов позволяет получить ближе к синапсы³¹.

Что касается микродиализом исследований в эпилептические животных важно подчеркнуть, что данные, полученные от большинства из них полагаются на видео или видео ЭЭГ мониторинг судорог, то есть, переходных вхождения признаки или симптомы из-за ненормального чрезмерное или синхронной активность нейронов в мозге³². Есть некоторые особенности электрографические изъятий в пилокарпин лечить животных, которые следует учитывать при подготовке эксперимента. Спонтанные судороги следуют депрессии активности с частыми ЭЭГ межприступная шипы³ и происходят в кластеры^33,34. Шам эксплуатируемых животных не эпилептическими припадками, могут демонстрировать захват как деятельность³⁵ и поэтому параметры для записи ЭЭГ оценки должны быть стандартные³⁶ , и, если возможно, должны быть четко определены сроки проведения сессий микродиализом. Наконец мы настоятельно рекомендуем следующие принципы и методологических стандартов для видео ЭЭГ-мониторинг управления взрослых грызунов изложенные экспертами Международная лига против эпилепсии и американского общества эпилепсии в своих последних докладах^{37 ,38}.

Здесь мы описываем микродиализом глутамата и аспартат параллельно с долгосрочной записи видео ЭЭГ в эпилептические животных и их анализ в диализате ВЭЖХ. Мы будем делать упор критические шаги протокола, один должен заботиться о для наилучшего результата.