نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.
سبر التعبير الجيني خلية واحدة يمكن التعرف على نوع الخلية والخلية الدولة. وقد ظهرت تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كأداة قوية لدراسة الملامح النسخي للخلايا، ولا سيما في الأنسجة غير المتجانسة مثل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، تفكك الأساليب المطلوبة لتسلسل وحيد الخلية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات تجريبية في وفاة خلية والتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب تقتصر عموما على أنسجة جديدة، مما يحد من دراسات بشأن المحفوظات والمواد البيولوجية-البنك. تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) هو بديل جذاب للدراسات النسخي، نظراً لأنه يحدد أنواع الخلايا بدقة، ويسمح بدراسة الأنسجة المجمدة أو يصعب فصل، ويقلل من فعل الانفصال النسخ. نقدم هنا، بروتوكول الفائق لعزل السريع من الأنوية للمتلقين للمعلومات سنرنا–ما يليها هذا الأسلوب يتيح عزل نواة من عينات النخاع الشوكي الطازجة أو المجمدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع اثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع.
الجهاز العصبي يتكون من مجموعات مستمدة من الخلايا التي تعرض مجموعة متنوعة من الخصائص المورفولوجية والبيوكيميائية والكهربية. أثناء تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة كانت مفيدة لتحديد التغيرات على صعيد الأنسجة في التعبير الجيني في ظروف مختلفة، فإنه يحول دون الكشف عن التغييرات النسخي على مستوى خلية واحدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في تحليل النسخي خلية واحدة قد مكنت تصنيف الخلايا ايربان إلى المجموعات الوظيفية استناداً إلى ذخيرتهم الجزيئية ويمكن حتى أن تكون الاستدانة للكشف عن مجموعات من الخلايا العصبية التي نشطت مؤخرا. 1 , 2 , 3 , 4 على مدى السنوات العشر الماضية، قد مكن تطوير الجيش الملكي النيبالي خلية مفردة التسلسل (سكرنا-Seq) دراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وتقديم وجهة نظر إلى تنوع من نوع الخلية. 5
وقدمت ظهور نهج قابلة للتطوير مثل سرنا موازية على نطاق واسع-Seq، منصات لتسلسل أنسجة غير متجانسة، بما في ذلك مناطق عديدة في الجهاز العصبي المركزي. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ومع ذلك، أساليب تفكك خلية مفردة يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، فضلا عن التغييرات التجريبية في التعبير الجيني. 16 العمل مؤخرا بتكييف أساليب تسلسل خلية واحدة لتمكين المحافظة على الملامح النسخي الذاتية. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 وكانت هذه الاستراتيجيات ملائمة بصفة خاصة للكشف عن التعبير الجيني (IEG) المبكر الفوري عقب التحفيز الحسي أو السلوك. 3 , 4 في المستقبل، هذه الاستراتيجية أيضا يمكن لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة في الحالات المرضية أو استجابة للتأكيد. من هذه الأساليب، هو تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) نهج واعدة التي لا تنطوي على الإجهاد يحفز تفكك الخلية ويمكن استخدامها على صعوبة أن تنأى بالانسجة (مثل الحبل الشوكي)، فضلا عن تجميد الأنسجة. 4 , 17 , 18 , 19 مواءمة من أساليب العزلة نويات السابقة،20،،من2122،،من2325 سنرنا Seq عادة يستخدم التقويض السريع الأنسجة والخلية تحلل تحت الظروف الباردة والطرد المركزي، وفصل النوى عن الحطام الخلوية. 4 نواة يمكن أن تكون معزولة لتسلسل الجيل المتلقين للمعلومات على منصات متعددة في تغليف الحبرية موائع جزيئية. 4 , 7 , 24 , 25 يسمح هذا الأسلوب للقطة من النشاط الترانسكربتي الآلاف من الخلايا في لحظة من الزمن.
وهناك استراتيجيات متعددة للإفراج عن نواة من الخلايا قبل عزلة والتسلسل، كل منها بمزاياها وعيوبها. هنا، يمكننا وصف ومقارنة البروتوكولين الملحقين بتمكين عزل نواة من الحبل الشوكي الكبار لكثافة موازية المتلقين للمعلومات سنرنا-Seq: تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية وتحلل ناقص التوتر والميكانيكية. ويوفر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية اختلال الأنسجة كاملة وارتفاع عائد نهائي من الأنوية. ناقص التوتر الميكانيكية-تحلل يتضمن درجة السيطرة عليها من اختلال الأنسجة، مما أتاح فرصة لتحديد توازن بين الكمية ونقاء الغلة النووي نهائياً. وتوفر هذه النهج مقارنة الحمض النووي الريبي الغلة، أرقام تم اكتشاف الجينات كل نواة، والتنميط نوع الخلية وأيضا على حد سواء استخدامها بنجاح لما يليها سنرنا
والهدف النهائي لهذا البروتوكول عزل الأنوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات. علينا تكييف أساليب Seq سنرنا أجل الشخصية كافة أنواع الخلايا في الحبل الشوكي. وفي البداية، وجدنا أن الخلية النموذجية الانفصال من أساليب غير فعالة لتسلسل وحيد الخلي?…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها برنامج NINDS داخلية (1 ضياء NS003153 02) و NIDCD (1 ضياء DC000059 18). ونحن نشكر لي ل. و C.I. دوبروت للدعم الفني ومناقشات مفيدة، وكاثي جيم لاستعراض المخطوطة.
Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |