Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van een anaërobe geheel cellen microbiële biosensor te evalueren van hoe verschillende milieu variabelen beïnvloeden de biodisponibiliteit van Hg en Cd voor bacteriën in een zuurstofvrije omgeving.
Kwik (Hg) biologische beschikbaarheid aan microben is een belangrijke stap naar giftige Hg biomagnificatie in voedsel webs. Cadmium (Cd) transformaties en biologische beschikbaarheid aan bacteriën bepalen het bedrag dat zich in het hoofdvoedsel gewassen ophopen zal. De biodisponibiliteit van deze metalen is afhankelijk van hun soortvorming in oplossing, maar meer in het bijzonder onder zuurstofvrije omstandigheden waar Hg is gemethyleerd aan giftige monomethylmercury (MeHg) en Cd aanhoudt in de rizosfeer. Hele cellen microbiële biosensoren geven een kwantificeerbare signaal als een metaal het cytosol binnenkomt en daarom nuttige tools zijn voor het evalueren van metalen biologische beschikbaarheid. Helaas hebben de meeste biosensing inspanningen tot nu toe is beperkt tot IME omgevingen als gevolg van de beperkte capaciteit van bestaande verslaggever eiwitten te laten functioneren in de afwezigheid van zuurstof. In dit onderzoek presenteren wij onze inspanning om te ontwikkelen en optimaliseren van een geheel-cel biosensor assay staat werking anaëroob dat metalen onder zuurstofvrije omstandigheden in quasi-real-time en binnen enkele uren detecteren kan. We beschrijven hoe de biosensor kan helpen beoordelen hoe chemische variabelen relevant zijn voor het milieu fietsen van metalen beïnvloeden hun biologische beschikbaarheid. Het volgende protocol bevat methoden ter (1) voorbereiding van Hg en Cd normen onder zuurstofvrije omstandigheden, (2) de biosensor bij gebrek aan zuurstof, (3) ontwerp voorbereiden en uitvoeren van een experiment om te bepalen hoe een aantal variabele beïnvloedt Hg of Cd biologische beschikbaarheid, en (4) te kwantificeren en te interpreteren biosensor gegevens. Wij tonen de lineaire bereiken van de biosensoren en bieden voorbeelden laten zien van de methode kunnen onderscheid maken tussen metalen biologische beschikbaarheid en toxiciteit door gebruik te maken van metal-afleidbare zowel constitutieve stammen.
Kwik (Hg) is een wereldwijde verontreinigende stof en de biologische beschikbaarheid aan Hg methylerend microben is de eerste stap naar de biomagnificatie via voedsel webs en mogelijk neurotoxische effecten in mens en natuur1. Er wordt op dit moment gedacht dat microbiële methylation van Hg is een intracellulair proces dat vereist: i) de soorten Hg als biologisch beschikbare2,3,4,5,6,7 en ii) voor de cel te kunnen fysiologisch methylerend Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioaccumulates in organismen, maar doet niet biomagnifies in foodwebs en wordt veel gebruikt in industriële en commerciële processen die vaak acute blootstelling in mensen en het milieu11 veroorzaken. Hoewel microben verschillende spelen een belangrijke rol in het lot van Hg in het milieu spelen, richten de meeste studies over Cd geochemie en ecotoxicologie op microbiële eukaryoten12. Consumptie van landbouwproducten (bijvoorbeeld rijst) is de belangrijkste bron van directe blootstelling aan cadmium; in dit geval de biodisponibiliteit van Cd naar microben van de rhizosfeer rechtstreeks van invloed op de hoeveelheid planten kunnen accumuleren13.
HG vervoer trajecten zijn complex en eventueel betrekken een actief transport stap14. Wanneer een vervoerder is betrokken, recent werk voorgesteld dat HgII een Zn gebruiktII of MnII transporter7,15,16,17. Overwegende dat de CdII is veronderstelde om per ongeluk worden vervoerd in het cytosol via divalente metalen vervoer wegen (vooral MnII of ZnII), mechanismen van CdII vervoer binnen de cellen blijven speculatieve en geen Cd-specifieke vervoer traject geweest geïdentificeerde13,18. Ongeacht de aard van de betrokken vervoerders, drie mechanistische factoren bepalen uiteindelijk het vermogen van metalen tot het invoeren van een cel: i) de metalen soortvorming in oplossing2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) de biophysiochemical eigenschappen van de celmembraan17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, en iii) de mogelijkheid voor het metaal tot een vervoer site7,32. CD en Hg zijn waarschijnlijk niet bestaat als vrije ionen microbiële fysiologisch relevante omstandigheden vanwege hun hoge affiniteit voor opgeloste organische materie (DOM), chelaat verontreinigingen (bijvoorbeeld EDTA), of zwavel wordt33, verminderd 34,35 (CdII kan bestaan als een vrije ion of formulier ion-paren in de afwezigheid van deze liganden). Er is een gebrek aan efficiënte methoden in om te bepalen hoe deze metalen soorten biologisch beschikbaar onder omstandigheden met betrekking tot hun lot in het milieu. Bijvoorbeeld, Hg is gemethyleerd onder anaërobe omstandigheden14, en zowel cadmium en Hg zijn zachte metalen (of klasse B kationen), vereisen dat hun soortvorming onder omstandigheden die de integriteit van verminderde zwavel groepen behouden worden onderzocht.
Microbiële biosensoren zijn bacteriële cellen die een kwantificeerbare signaal in reactie op de intracellulaire concentraties van metaal, in dit geval Hg of Cd uitstoten. Als zodanig zijn ze ideaal hulpmiddelen om te begrijpen hoe metalen Voer een cel36, mits de blootstellingsvoorwaarden zijn zorgvuldig gecontroleerd voor. HG biosensoren bevatten doorgaans gene fusies tussen de regelgevende circuits van de mer-operon (inclusief genen coderend voor de transcriptie regulator MerRas evenals de operator en de promotor voor regio’s van het operon), query’s en rapporten genen (b.v., Lux, gfp, lac genen). Als kwik in het cytoplasma aanwezig is, zal het binden aan MerR, resulterend in de transcriptie van de rapportage genen en de daaropvolgende signaal productie19,37. Specifieke Cd biosensoren zijn meestal ontworpen met behulp van de cadC, cadAC, zntA of zntR gecodeerd transcriptie regelgevers38, maar het is vermeldenswaard dat MerR een lagere, maar meetbare affiniteit met Cd5 heeft. Als gevolg van aërobe beperking van de meeste gebruikte luminescent of TL verslaggever eiwitten, totdat onlangs microbiële biosensoren bleef niet bieden inzicht in de biotransformatie van metalen onder zuurstofvrije omstandigheden. Dit maakt anaërobe opsporing van metalen biobeschikbaarheid zeer moeilijk over een scala van omstandigheden relevant zijn voor hun verspreiding in het milieu, specifiek in het bijzijn van de redox gevoelige liganden (bijvoorbeeld sulfide en thiolen)4, 5 , 39.
Ter verzachting van de methodologische horde van beeldvorming bij gebrek aan zuurstof, Drepper et al. leven (2007) hebben een flavin gebaseerde fluorescente proteïne (FbFp) ontwikkeld, gebaseerd op lichte zuurstof-spanning domein SB2 eiwit van P. putida. Deze eiwit-familie vermag fluoresceren bij gebrek aan zuurstof40. Voortbouwend op de werkzaamheden van Drepper et al., ontworpen ons lab een anaërobe biosensor waardoor voor de studie van Hg biobeschikbaarheid IME en zuurstofvrije omstandigheden en over een breed scala aan zoutgehalte 17. In het huidige document beschrijven we hoe te bereiden en gebruiken van de biosensor om te testen omgevingsvariabelen invloed op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Hoewel we de biosensor ontwikkeld voor HgII, kozen we voor het uitvoeren van experimenten met CdII als een middel om te trekken de aandacht van de lezer op het feit dat biosensoren reageert ook op meerdere stressoren die zijn waarschijnlijk mede in milieu matrices; in dit geval CdII werd onderzocht omdat het is bekend om te binden aan de transcriptionele regelgever MerR5. Hier, laten we representatieve kalibratie en functionele lineaire bereiken met betrekking tot beide metaal. Ook geven wij een voorbeeld wanneer de biosensor de resultaten zijn overtuigend (MgII en MnII over Hg biologische beschikbaarheid) en onduidelijk (ZnII over Hg biologische beschikbaarheid).
Microbiële biosensoren zijn nuttige hulpmiddelen om te identificeren van de mechanismen waarmee metalen zijn interactie met microben. Hier beschrijven we een methode die Hg anaëroob kan kwantificerenII en CdII biologische beschikbaarheid tot een gram-negatieve gastheercel (E. coli) en geven een meetbaar resultaat binnen een paar uur. Een van de belangrijkste troeven van dit protocol is dat het mogelijk uitgebreide controle van metalen soortvorming in het blootstelling medium maakt door het vermijden van sterke bindende liganden of componenten die tot metalen neerslag leiden kunnen. Metaal speciatie is gemodelleerd en getest in dit medium van de blootstelling met behulp van de PHREEQC17, maar andere metaal speciatie-software kan worden ingezet. In het geval van geen toegevoegde liganden, Hg soortvorming verwachting aanwezig te zijn als 97% Hg(OH),2 en 3% Hg (NH3)22 +, terwijl Cd soortvorming zullen presenteren als 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +en 16% CdSO4. Met behulp van een eenvoudige thermodynamische modellering software, kan de gebruiker blootstelling media ontwerpen en testen voor de biodisponibiliteit van het metaal van belang. Daarnaast de gastheercel biosensor (E. coli NEB5α) haalbaar is over een brede waaier van pH (5-8.5) en concentratie van de NaCl (0-0,55 M)17.
Methylation van HG is een anaerobe proces, en het protocol geschetst in deze studie hoeft niet een vereiste voor zuurstof, waardoor meer accurate beschrijving van anaërobe metabolisme op metalen biologische beschikbaarheid. Dit is belangrijk omdat de aanwezigheid van zuurstof gen expressie profielen48,49 verandert , en vandaar, potentieel vervoer trajecten; Deze methode stelt daarom een voordeel ten opzichte van momenteel bestaand aërobe alternatieven. De constructie van de biosensing hier gepresenteerde potentieel kan worden gebruikt met andere anaërobe hosts die relevant meer voor kwik methylering (bijv. Geobacter, Desulfovibrio), maar misschien zijn kunnen minder hanteerbare dan E. coli. Een van de huidige beperking van de hier gepresenteerde benadering is dat onze limiet van detectie pM niveaus, in tegenstelling tot bestaande aërobe systemen4,–19,37nog niet heeft bereikt. Het is echter belangrijk op te merken dat om deze lage detectiegrenzen verschillende stappen dienen te worden genomen44: ik) ligand toevoeging is vereist om ervoor te zorgen dat Hg in de oplossing blijft en niet op de microbiële celwand (Hg zullen onomkeerbaar gebonden doet adsorberen naar een cel oppervlakte thiolen voorkomen zijn biologische beschikbaarheid25,27; Zie de reactie van de drempel voor Hg in figuur 3A), ii) wijzigingen van de celdichtheid, of iii) wijzigen van de genetische constructie tot vervoer proteïnen van de mer-operon (namelijk merT pt merP), toenemende Hg flux binnen de cel50,51. Deze wijzigingen zou heilzaam bij de opsporing van de lage concentraties van Hg, maar niet noodzakelijkerwijs ideaal bij de beoordeling van de milieu relevante situaties. Overwegende dat eerdere cadmium biosensoren bestaan voornamelijk als een “proof of principe”, werden ze ontworpen in complexe media die niet toestaan de onderzoeker te beoordelen van de rol van soortvorming op biologische beschikbaarheid41,42, 43 , 44.
De biosensor is een ongelooflijk nuttig hulpmiddel bij het bepalen van de mechanismen waarin metalen soorten biologisch beschikbaar zijn. Omdat het ontvangende organisme niet een Hg-methylator is, kan het uitsluitend gebruikt voor het ontwikkelen van een model voor hoe Hg gram-negatieve bacteriën en niet een definitieve reden voor hoe Hg-methylators Hg verwerven kan invoeren. Er bestaan andere methoden voor de bepaling van de biologische beschikbaarheid Hg, zoals methylering, als een resultaat van opname of het gebruik van een massabalans aanpak10,15,20,45,,46. Dat gezegd zijnde, biedt de hier voorgestelde methode het voordeel van quasi real time-gegevens van de biologische beschikbaarheid in levensvatbare cellen. Wij adviseren niet dat deze methode worden gebruikt om de totale Hg of Cd niveaus in een milieu matrix te kwantificeren. Ondanks het voorgestelde gebruik van biosensoren om metalen concentraties in het milieu36, zijn veel meer beschikbaar standaardmethoden beschikbaar zoals ICP-MS, FAAS (p.a. Cd) of koude damp-atomaire absorptie spectroscopie (voor Hg analyse). De biosensor kan echter worden gebruikt om te bepalen als een bepaald milieu matrix heeft het potentieel om te verbeteren of belemmeren van biologische beschikbaarheid; Dit wordt bereikt door het uitvoeren van de Standaardextra.
De pH van de media blootstelling mag worden gewijzigd om overal binnen de waaier van 5 en 8,5, mits de MOPS vrije zure (buffer) wordt uitgewisseld met een alternatieve vrij zuur van een buffer met de desbetreffende pKa (zie lijst van passende buffers (Ferreira et al. (2015) 47) en aangepast met KOH aan de juiste pH-waarde bij het maken van de media van de blootstelling. Bovendien, de methode is niet beperkt tot Hg en Cd, maar kan worden uitgebreid tot andere metalen met behulp van andere regelgevers van de transcriptie.
De bepaling van de blootstelling kan worden gewijzigd om te verkennen van de invloed van andere elektronen acceptoren zoals O2 en fumaraat op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Kleine wijzigingen in de methode te gebruiken zowel O2 en fumaraat als elektronen acceptoren zijn beschikbaar op aanvraag.
Kortom, we willen graag de volgende punten: ik) is het absoluut noodzakelijk dat de concentraties van Cd of Hg voorraden zijn bekend in stap 2, zoals deze wordt gebruikt voor het kalibreren van de biosensor. II) op de dag van de blootstelling, de groei van cellen moet worden gestopt bij een OD-600 voor 0.6 (± 0,1) en dat de zorg wordt genomen bij de resuspending van de celculturen, als de biosensor is gekalibreerd om de celdichtheid van deze. III) ten slotte, het is belangrijk dat het medium blootstelling minutieus op de dag van de blootstelling geschiedt. Om ervoor te zorgen het succes van het protocol, meerdere culturen tegelijk (te omzeilen de mogelijkheid van groei storing) moeten worden gekweekt en het groeimedium moet wekelijks worden vernieuwd (om te omzeilen de metastabiliteit van de media en de eventuele verontreiniging). Ook opgemerkt moet worden dat biologische replicatieonderzoeken (meerdere celculturen) variabiliteit kenbaar te maken wanneer het gaat om het signaal van de productie. Hoewel de fluorescerende reacties van cultuur tot cultuur variëren kunnen, moeten de fluorescerende trends in reactie op een gegeven variabele blijven hetzelfde tijdens talrijke biologische replicatieonderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
We bedank opmerkingen van twee Anoniem reviewers als ook leden van de Poulain Lab voor inzichtelijke discussie over de ontwikkeling van de anaërobe biosensor. Deze studie wordt gefinancierd door een Early onderzoeker Award van de provincie Ontario en de toekenning van een ontdekking en een aanvulling van de versneller van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada op A.J.P..
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |