यहां, हम एक anaerobic पूरे सेल माइक्रोबियल जैव संवेदक का मूल्यांकन करने के लिए कैसे विभिंन पर्यावरणीय चर पारा और anoxic वातावरण में बैक्टीरिया को सीडी की जैव उपलब्धता को प्रभावित करने का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।
पारा (पारा) रोगाणुओं को जैव उपलब्धता खाद्य जाले में विषाक्त पारा अधिक इज़ाफ़ा करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । कैडमियम (सीडी) परिवर्तनों और बैक्टीरिया को जैव उपलब्धता मात्रा है कि प्रधान खाद्य फसलों में जमा होगा नियंत्रण । इन धातुओं की जैव उपलब्धता समाधान में उनके speciation पर निर्भर है, लेकिन अधिक विशेष रूप से anoxic स्थितियों जहां पारा विषाक्त monomethylmercury (MeHg) को methylated है और सीडी rhizosphere में बनी हुई है । पूरे सेल माइक्रोबियल जैव सेंसर एक quantifiable संकेत दे जब एक धातु cytosol में प्रवेश करती है और इसलिए उपयोगी उपकरण धातु जैव उपलब्धता का आकलन कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, सबसे अधिक संवेदन प्रयास अब तक मौजूदा रिपोर्टर प्रोटीन ऑक्सीजन के अभाव में कार्य करने की सीमित क्षमता के कारण वातावरण oxic करने के लिए विवश किया गया है । इस अध्ययन में, हम अपने को विकसित करने और एक पूरी सेल anaerobically कि अर्ध में anoxic हालत वास्तविक समय और घंटे के भीतर धातुओं का पता लगा सकते है काम करने में सक्षम परख का अनुकूलन प्रयास वर्तमान । हम का वर्णन कैसे जैव सेंसर की मदद कर सकते है कैसे रासायनिक चर धातुओं की पर्यावरण साइकिल चालन के लिए प्रासंगिक उनके जैव उपलब्धता को प्रभावित । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए विधियां शामिल है (1) anoxic शर्तों के तहत पारा और सीडी मानकों को तैयार, (2) ऑक्सीजन के अभाव में जैव संवेदक तैयार, (3) डिजाइन और एक प्रयोग को लागू करने के लिए निर्धारित कैसे चर की एक श्रृंखला पारा या सीडी जैव उपलब्धता को प्रभावित करता है, और (4) को यों तो और अधिक सेंसर डेटा की व्याख्या । हम जैव सेंसर के रैखिक पर्वतमाला दिखाने के लिए और दोनों धातु-inducible और गठन उपभेदों का उपयोग करके धातु जैव उपलब्धता और विषाक्तता के बीच अंतर करने के लिए विधि की क्षमता दिखा उदाहरण प्रदान करते हैं.
बुध (पारा) एक वैश्विक प्रदूषक और पारा methylating रोगाणुओं के लिए अपने जैव उपलब्धता है खाद्य जाले और उसके मानव और वंय जीवन में संभव neurotoxic प्रभाव के माध्यम से अपनी वृद्धि की दिशा में पहला कदम है1। यह वर्तमान में सोचा है कि माइक्रोबियल पारा मिथाइल एक intracellular प्रक्रिया की आवश्यकता है कि: i) पारा की प्रजातियों के लिए उपलब्ध हो2,3,4,5,6,7 और द्वितीय) कोशिका के लिए शारीरिक रूप से सक्षम होना methylating पारा8,9,10। कैडमियम (सीडी) जीवों में संचित, लेकिन foodwebs में biomagnifies नहीं है और व्यापक रूप से औद्योगिक और वाणिज्यिक प्रक्रियाओं है कि आमतौर पर लोगों और पर्यावरण11में तीव्र जोखिम के कारण में प्रयोग किया जाता है । हालांकि रोगाणुओं के माहौल में पारा के भाग्य में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा, सीडी geochemistry और ecotoxicology पर सबसे अधिक अध्ययन माइक्रोबियल eukaryotes12पर ध्यान केंद्रित । कृषि फसलों की खपत (जैसे, चावल) कैडमियम को प्रत्यक्ष जोखिम का मुख्य स्रोत है; इस मामले में, rhizosphere के रोगाणुओं के लिए सीडी की जैव उपलब्धता सीधे राशि पौधों13जमा कर सकते है प्रभावित करता है ।
पारा परिवहन रास्ते जटिल है और संभवतः एक सक्रिय परिवहन चरण14शामिल है । जब एक ट्रांसपोर्टर शामिल है, हाल ही में काम का सुझाव दिया है कि पाराद्वितीय एक Znद्वितीय या Mnद्वितीय ट्रांसपोर्टर7,15,16,17का उपयोग करता है । जबकि सीडीद्वितीय गलती से divalent धातु परिवहन रास्ते (विशेष रूप सेद्वितीय या Znद्वितीय), कोशिकाओं के अंदर सीडीद्वितीय परिवहन के तंत्र के माध्यम से cytosol में ले जाया जा कल्पना की है सट्टा, और कोई सीडी विशिष्ट परिवहन मार्ग13,18की पहचान की गई है । शामिल ट्रांसपोर्टरों की प्रकृति की परवाह किए बिना, तीन यंत्रवत कारकों अंततः एक सेल में प्रवेश करने के लिए धातुओं की क्षमता का निर्धारण: i) समाधान2,6,15में धातु speciation, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) कोशिका झिल्ली के biophysiochemical गुण17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, और iii) धातु के लिए एक परिवहन साइट7,३२का उपयोग करने की क्षमता । सीडी और पारा की संभावना नहीं है माइक्रोबियल शारीरिक रूप से प्रासंगिक विखंडित कार्बनिक पदार्थ (डोम), chelating संदूषण (जैसे, EDTA), या कम सल्फर moieties३३के लिए उच्च समानता के कारण स्थितियों के तहत मुक्त आयनों के रूप में मौजूद है, ३४,३५ (सीडीद्वितीय इन लाइगैंडों के अभाव में एक मुक्त आयन या फार्म आयन-जोड़े के रूप में मौजूद कर सकते हैं) । वहां कैसे इन धातु प्रजातियों के वातावरण में उनके भाग्य के लिए प्रासंगिक शर्तों के तहत उपलब्ध है निर्धारित करने में कुशल तरीकों की कमी है । उदाहरण के लिए, पारा anaerobic शर्तों14के तहत methylated है, और दोनों कैडमियम और पारा नरम धातुओं (या वर्ग बी cations) हैं, की आवश्यकता है कि उनकी speciation शर्तों के तहत जांच की है कि कम सल्फर समूहों की अखंडता बनाए रखने के ।
माइक्रोबियल जैविक संवेदी जीवाणु कोशिकाओं है कि एक धातु के intracellular सांद्रता के जवाब में एक quantifiable संकेत फेंकना, इस मामले में पारा या सीडी में हैं । जैसे, वे आदर्श उपकरण है समझने की कैसे धातुओं एक सेल३६, बशर्ते कि जोखिम शर्तों ध्यान के लिए नियंत्रित कर रहे है दर्ज करें । पारा-संवेदी आमतौर पर मेर-ऑपरोन के विनियामक सर्किट के बीच जीन फ्यूजन शामिल (प्रतिलेखन नियामक के लिए एंकोडिंग MerRas के रूप में अच्छी तरह से ऑपरेटर और ऑपरोन के प्रवर्तक क्षेत्रों सहित), और जीन रिपोर्टिंग (जैसे, लक्स, gfp, लाख जीन) । जब पारा कोशिका द्रव्य में मौजूद है, यह MerR को बांध, रिपोर्टिंग जीन और बाद में संकेत उत्पादन19,३७की प्रतिलेखन में जिसके परिणामस्वरूप होगा । विशिष्ट सीडी आमतौर पर cadC, cadAC, zntA या zntR इनकोडिंग प्रतिलेखन नियामकों३८का उपयोग कर डिजाइन किए हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य बात है कि MerR एक कम है, अभी तक quantifiable संबंध सीडी5। सबसे अधिक इस्तेमाल किया luminescent या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के एरोबिक प्रतिबंध के कारण, हाल ही में सूक्ष्म जीवाणुओं जब तक कि anoxic शर्तों के तहत धातुओं के जैविक रूपांतरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में असमर्थ रहे । यह उनके पर्यावरणीय भाग्य के लिए प्रासंगिक स्थितियों की एक सीमा से अधिक बहुत मुश्किल धातुओं जैव उपलब्धता का anaerobic पता लगाने बनाता है, विशेष रूप से redox संवेदनशील लाइगैंडों की उपस्थिति में (जैसे, सल्फाइड और thiols)4, 5 , ३९.
ऑक्सीजन के अभाव में लाइव इमेजिंग की methodological बाधा को दूर करने के लिए Drepper एट अल. (२००७) एक फ्लेविन आधारित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FbFp) विकसित किया है, SB2 प्रोटीन के प्रकाश ऑक्सीजन वोल्टेज डोमेन के आधार पर पी putidaसे । यह प्रोटीन परिवार ऑक्सीजन४०के अभाव में fluoresce करने में सक्षम है । Drepper एट अलके काम पर बिल्डिंग, हमारी प्रयोगशाला एक anaerobic oxic और anoxic शर्तों के तहत पारा जैव उपलब्धता के अध्ययन के लिए अनुमति सेंसर डिजाइन और 17लवणता की एक विस्तृत श्रृंखला पर । वर्तमान समाचार पत्र में, हम का वर्णन कैसे तैयार करने के लिए और जैव सेंसर का उपयोग करने के लिए पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर पर्यावरण ‘ चर प्रभाव का परीक्षण । हालांकि हम पाराद्वितीयके लिए विकसित संवेदक, हम एक के रूप में सीडीद्वितीय के साथ प्रयोग करने का फैसला किया तथ्य यह है कि अधिक से अधिक तनाव का जवाब भी कर सकते है पाठक का ध्यान आकर्षित करने का मतलब है कि सह की संभावना है पर्यावरण में होते है matrices इस मामले में सीडीद्वितीय की जांच की गई क्योंकि यह transcriptional नियामक MerR5से बाइंड करने के लिए जाना जाता है । यहां, हम या तो धातु के संबंध में प्रतिनिधि अंशांकन और कार्यात्मक रैखिक पर्वतमाला दिखाते हैं । हम भी एक उदाहरण देते है जब जैव सेंसर के परिणाम निर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर एमजीद्वितीय और Mnद्वितीय ) और अनिर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर Znद्वितीय ) ।
सूक्ष्म जीवाणुओं जो धातुओं रोगाणुओं के साथ बातचीत कर रहे है तंत्र की पहचान करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं । यहां, हम एक विधि है कि एक ग्राम नकारात्मक मेजबान सेल (ई. कोलाई) और एक quantifiable परिणाम देने के लिए पाराद्वितीय और सीडीद्वितीय उपलब्धता anaerobically यों तो कुछ ही घंटों के भीतर कर सकते है वर्णन । इस प्रोटोकॉल की प्रमुख शक्तियों में से एक यह है कि यह मजबूत बाध्यकारी लाइगैंडों या घटक है कि धातु वर्षण के लिए नेतृत्व कर सकते है परहेज द्वारा जोखिम के माध्यम में धातु speciation के व्यापक नियंत्रण की अनुमति देता है । धातु speciation मॉडलिंग की है और PHREEQC17का उपयोग कर इस जोखिम मध्यम में परीक्षण किया गया है, तथापि अंय धातु speciation सॉफ्टवेयर तैनात किया जा सकता है । कोई जोड़ा लाइगैंडों के मामले में, पारा speciation को ९७% पारा (OH)2 और 3% पारा (NH3)22 +के रूप में उपस्थित होने की उंमीद है, जबकि सीडी speciation ५९% सीडी के रूप में उपस्थित होंगे-β-Glycerophosphate, 25% सीडी2 +, और 16% CdSO4। एक सरल ऊष्मा मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, उपयोगकर्ता जोखिम मीडिया और ब्याज की धातु की जैव उपलब्धता के लिए परीक्षण डिजाइन कर सकते हैं । इसके अलावा, इस (5-8.5) और NaCl एकाग्रता (0-0.55 मी)17पीएच की एक विस्तृत श्रृंखला से अधिक व्यवहार्य है, (ई. कोलाई NEB5α) सेंसर मेजबान सेल ।
पारा मिथाइल एक anaerobic प्रक्रिया है, और इस अध्ययन में उल्लिखित प्रोटोकॉल ऑक्सीजन के लिए एक आवश्यकता नहीं है, धातु जैव उपलब्धता पर anaerobic चयापचय का अधिक सटीक विवरण के लिए अनुमति देता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑक्सीजन की उपस्थिति जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल४८,४९ और इसलिए, संभावित परिवहन रास्ते बदल; इसलिए इस विधि वर्तमान में exising एरोबिक विकल्प पर एक लाभ प्रस्तुत करता है । यहां प्रस्तुत की गई संवेदना का निर्माण संभावित रूप से अन्य anaerobic होस्ट के साथ किया जा सकता है जो बुध मिथाइल (उदा., Geobacter, Desulfovibrio) के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकते हैं, लेकिन शायद ई. कोलाईसे कम हो । यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की एक मौजूदा सीमा है कि पता लगाने की हमारी सीमा अभी तक पीएम स्तर तक पहुंच नहीं है, मौजूदा एरोबिक सिस्टम के विपरीत4,19,३७। लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें कि इन कम पता लगाने की सीमा को प्राप्त करने के लिए कई कदम उठाए जाने की जरूरत है४४: i) ligand अतिरिक्त यह सुनिश्चित करना है कि पारा समाधान में रहता है और माइक्रोबियल सेल की दीवार पर adsorb नहीं है की आवश्यकता है (पारा अपरिवर्तनीय होगा बाध्य सेल सतह thiols अपनी जैव उपलब्धता को रोकने के लिए25,27; चित्रा 3ए में पारा के लिए दहलीज प्रतिक्रिया देखें), द्वितीय) सेल घनत्व में संशोधन, या iii) आनुवंशिक निर्माण के लिए मेर-ऑपरोन के परिवहन प्रोटीन शामिल करने के लिए संशोधित (अर्थात् merT और merP), बढ़ती पारा फ्लक्स कक्ष के अंदर५०,५१. ये संशोधन पारा के कम सांद्रता का पता लगाने में फायदेमंद है, लेकिन जरूरी नहीं कि आदर्श जब पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्थितियों का आकलन होगा । जबकि पिछले कैडमियम जैव सेंसर मुख्य रूप से एक “सिद्धांत का सबूत” के रूप में मौजूद हैं, वे जटिल मीडिया है कि अंवेषक की अनुमति नहीं है में डिजाइन किए गए जैव उपलब्धता४१,४२ पर speciation की भूमिका का आकलन करने के लिए, ४३ , ४४.
इस में एक अविश्वसनीय रूप से उपयोगी उपकरण है तंत्र के निर्धारण में जो धातु प्रजातियों में उपलब्ध है । क्योंकि मेजबान जीव एक पारा-methylator नहीं है, यह केवल कैसे पारा ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और नहीं कैसे पारा-methylators पारा अधिग्रहण के लिए एक निश्चित औचित्य दर्ज कर सकते है के लिए एक मॉडल विकसित किया जा सकता है । अन्य विधियां जैसे कि मिथाइल के रूप में पारा जैव उपलब्धता का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं, एक परिणाम के रूप में या एक सामूहिक संतुलन दृष्टिकोण10,15,20,४५,४६का उपयोग करें । कहा जा रहा है कि, विधि यहां प्रस्तुत व्यावहारिक कोशिकाओं में अर्ध वास्तविक समय जैव उपलब्धता डेटा का लाभ प्रदान करता है । हम अनुशंसा करते है कि इस विधि के लिए एक पर्यावरणीय मैट्रिक्स में कुल पारा या सीडी का स्तर यों तो इस्तेमाल किया जा नहीं है । ३६पर्यावरण में धातु सांद्रता निर्धारित करने के लिए, कई और अधिक आसानी से उपलब्ध मानक तरीकों जैसे आईसीपी-MS, FAAS (सीडी विश्लेषण के लिए) या शीत वाष्प परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (पारा के लिए) के रूप में उपलब्ध हैं । विश्लेषण). हालांकि एक पर्यावरण मैट्रिक्स को बढ़ाने या जैव उपलब्धता में बाधा की क्षमता है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह मानक जोड़ प्रदर्शन से प्राप्त की है ।
जोखिम मीडिया के पीएच को कहीं भी 5 और ८.५ की सीमा के भीतर बदल दिया जा सकता है, MOPS मुक्त एसिड (बफर) प्रदान की उपयुक्त pKa के साथ एक बफर के एक वैकल्पिक मुक्त एसिड के साथ विमर्श किया है (कृपया उचित बफ़र्स की सूची (फरेरा एट अल देखें । (२०१५) ४७) और उचित पीएच को KOH के साथ समायोजित जब जोखिम मीडिया बना । इसके अलावा, विधि पारा और सीडी तक ही सीमित नहीं है, लेकिन अंय प्रतिलेखन नियामकों का उपयोग कर अंय धातुओं के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
जोखिम परख जैसे हे2 और fumarate पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर अंय इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों के प्रभाव का पता लगाने के संशोधित किया जा सकता है । विधि के लिए मामूली संशोधन दोनों ओ2 और fumarate के रूप में इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने का उपयोग अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।
सारांश में हम निंनलिखित बातों पर जोर देना चाहूंगा: I) यह आवश्यक है कि सीडी या पारा शेयरों की सांद्रता चरण 2 में जाना जाता है, के रूप में इन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में इन सेंसर । जोखिम दिवस पर द्वितीय) , कोशिकाओं की वृद्धि ०.६ के एक आयुध डिपो६०० पर रोका जाना चाहिए (± ०.१) और है कि देखभाल के लिए सेल संस्कृतियों resuspend जब लिया जाता है, के रूप में इस कोशिका घनत्व के लिए पर तुले है । III) अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि जोखिम के माध्यम जोखिम दिन पर कुशलता से किया जाता है । प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कई संस्कृतियों एक साथ उगाया जाना चाहिए (विकास की विफलता की संभावना को दरकिनार करने के लिए) और विकास के माध्यम साप्ताहिक (मीडिया और संभव संदूषण के metastability को दरकिनार करने के लिए) किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जैविक प्रतिकृति (एकाधिक सेल संस्कृतियों) एक्सप्रेस परिवर्तनशीलता जब यह उत्पादन संकेत करने के लिए आता है । हालांकि फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं संस्कृति से संस्कृति के लिए भिंन हो सकते हैं, एक दिया चर के जवाब में फ्लोरोसेंट प्रवृत्तियों कई जैविक प्रतिकृति में ही रहना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
हम दो गुमनाम समीक्षक से टिप्पणी के रूप में अच्छी तरह से anaerobic के विकास पर व्यावहारिक चर्चा के लिए Poulain लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना होगा । ओंटारियो के प्रांत से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार और एक खोज अनुदान और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद से एक त्वरक पूरक A.J.P. इस अध्ययन वित्त पोषित करने के लिए ।
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |