Изоляция и Decellularization целом свинину поджелудочной железы
Summary
Тканевая инженерия всей поджелудочной железы является проблемой из-за своей эндокринной и экзокринной функции. Мы покажем метод для рассечения нетронутыми свинину поджелудочной железы и процесса успешных decellularization, перфузии моющих средств X-100 Тритон, Дезоксихолат натрия и дезоксирибонуклеаза.
Abstract
Тканевая инженерия всей поджелудочной железы может улучшить текущего лечения сахарного диабета. Конечная цель является инженер поджелудочной железы ткани из аллогенной или культивированная источника с клеток человека. Демонстрация методов эффективного рассечение, decellularization и recellularization свинину поджелудочной железы может принести пользу области. Сродни человека поджелудочная железа, свинину поджелудочная железа имеют специальное анатомическое соглашение с тремя лопастями (селезеночной, двенадцатиперстной кишки и подключения) округлые, двенадцатиперстной и тонкой кишки. Двенадцатиперстной кишки мочку поджелудочной железы подключается в двенадцатиперстную кишку, несколько мелких кровеносных сосудов. Тканевая инженерия поджелудочной железы является сложным из-за своей эндокринной и экзокринной характер. В этой статье мы покажем подробный протокол вскрыть всю свинину поджелудочной железы и decellularize его с моющими средствами при сохранении своей структуры и некоторые компоненты внеклеточного матрикса. Для достижения полной перфузии, аорты выбирается в качестве входного и воротной вены как выход. Лигируют других кровеносных сосудов (печеночная артерия, селезеночной вены, Селезеночной артерии, верхней брыжеечной артерии и Вены дерево) и желчных протоков. Для предотвращения формирования тромбов, свинья является гепаринизированным и, сразу после вскрытия, орган промывается холодной гепарина. Для подавления действия экзокринной ферментов, поджелудочной decellularization установлен на 4 ° C. Decellularization осуществляется перфузии Тритон X-100, Дезоксихолат натрия и дезоксирибонуклеаза, с прерывистой и окончательный обширные промывкой. С успешным decellularization поджелудочной железы появляется белый, и гистологической оценки с гематоксилином и эозином показывает отсутствие ядер с структуры сохранились внеклеточного матрикса. Таким образом предложенный метод может использоваться для успешного рассекать и decellularize весь свинину поджелудочной железы.
Introduction
Сахарный диабет характеризуется наличием повышенного уровня глюкозы в крови. Он признан проблемой общественного здравоохранения в большинстве стран1. Высокий уровень глюкозы в крови влияет на кровеносные сосуды и нервную систему, вызывая повреждение глаза, сердце, почки, и ишемии конечности. Традиционные методы лечения включают в себя инъекции экзогенного инсулина, наркотиков и изменения образа жизни. Отложив в сторону для лечения этого заболевания, в некоторых случаях, доступные методы лечения не в состоянии поддерживать инсулина на терапевтических уровнях, что приводит к гипергликемии. Хотя трансплантация островков или всей поджелудочной железы устраняет болезни, не делается это обычно из-за нехватки подходящих доноров органов и риски и трудности от2иммуносупрессии и инкапсуляции.
Текущий улучшений в области инженерных и регенеративной медицины ткани обладают потенциалом для обеспечения решения для этих проблем. С техникой decellularization клеточного материала от человека или животных доноров могут быть удалены во время важных внеклеточного матрикса (ECM) белки, факторы роста, и в леса сохранились сигнальных молекул. Такие леса потенциально могут быть трансплантированы без необходимости иммуносупрессия, чтобы восстановить функции органа после recellularization с получателя и не иммуногенность стволовые клетки3,4. Ткани инженерных органов из аллогенной или культивированная источников может использоваться в клинической трансплантологии, как белки основных внеклеточной матрицы сохраняются среди видов и не может быть отклонена после пересадки5.
Decellularization это хорошо изучить метод оптимального применения физической силы, химических моющих средств и ферментов в физиологической установки для удаления клеток и ядерный материал из ткани или органа. Recellularization — это процедура заполнения ячейки обратно в ацеллюлярной орган. Это интеллектуально жесткой процедурой, требующей большое количество клеток, оптимального заполнения ячейки стратегии и системы биореактор для культуры органа на физиологически приемлемых условий, как температура, давление и газов6.
Поджелудочной железы можно рассматривать сложные ткани для тканевой инженерии из-за своей эндокринной и экзокринной возможностей. Экзокринной ткани выделяет несколько пищеварительные ферменты, в то время как эндокринная часть выделяет гормоны, включая инсулин. Decellularization нетронутыми поджелудочная железа от мыши7,8, человека9и10 свиней уже сообщалось с помощью ферменты (трипсин, дезоксирибонуклеаза [DNase]) и неионных (Тритон X-100) и ионной моющих средств ( Дезоксихолат натрия [SDC] и лаурилсульфат натрия [ПБ]). Однако после опубликованные протоколы, мы боролись с успешным диссекции и полный перфузии и decellularization при сохранении структуры ECM. Мы предположили, что применяемых моющих средств во время decellularization вызывают лизис клеток, высвободив тем самым пищеварительные ферменты в орган. Выпущенные ферментов нанести необратимый ущерб на эшафот ECM и сделать его неэффективным для decellularization и recellularization. Дизайн метод, который эффективно decellularizes поджелудочной железы при подавляя действие пищеварительных ферментов может решить эту проблему. Мы выбрали стратегию Пелозо et al., о decellularization поджелудочной железы при холодной температуре, хотя они не сообщают о том, почему холодной температуры используется9. В то же время мы разработали стратегию диссекции с изменениями от Taylor et al. , выбрав аорты как перфузии впуска через ствол Целиакия (КТ) и превосходной верхней брыжеечной артерии (SMA)11.
В недавно опубликованной статье12мы демонстрируем метод для эффективной изоляции и decellularization свинину поджелудочной железы при сохранении некоторых компонентов ECM. В этом документе мы показать подробное описание как вскрыть весь свинину поджелудочной железы содержащие селезеночной, двенадцатиперстной кишки и подключение лопастями и настоящее время поэтапного протокол для успешного decellularization.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предлагаемый протокол, с помощью перфузионного SDC и Тритон X-100 на 4 ° C, будут успешно decellularize целом свинину поджелудочной железы. В этой технике стоит задача рассечение нетронутыми поджелудочной железы, содержащий все тремя лопастями без повреждения паренхимы и снабжения судов, а также лигирование других сосудистых ветвей образца для того, чтобы perfuse орган без утечки. Свинину поджелудочной железы имеет различные анатомии, по сравнению с человека поджелудочной железы. Он состоит из трех долей и остается в тесном контакте с тонкой кишки, частично вокруг него. Мы анализировали двенадцатиперстную кишку вместе с поджелудочной железы, как подключить несколько мелких кровеносных сосудов из поджелудочной железы ЖКТ. Во время оптимизации исследований тупым резки этих кровеносных сосудов показал утечки и неполной перфузии решений.
Так как аорты подключается к поджелудочной железы через Целиакия и превосходной верхней брыжеечной артерии, мы выбрали аорты как входе для простоты перфузии, только используя один канюли и, следовательно, один вход. По нашему опыту лигирование аорты выше CT и ниже SMA сократит время вскрытия и уменьшает риск повреждения любого из двух судов. В дополнение к гепаринизированным свинья мы также заметили, что перфузии холодной гепарина через аорту сразу после вскрытия помогает в достижении перфузии решений на протяжении всего органа. Мы предположить, если это происходит, предотвращая образование тромбов в кровеносных сосудах. Начальной перфузии поджелудочной железы с ультрачистая вода после рассечения лизируют красных кровяных клеток и удалите остатки крови в органе, тем самым предотвращая образование сгустков крови. Этот период может также использоваться для поиска любого unligated веточек вен и артерий, как поток крови может быть легко заметили выше фона.
Мы решили сохранить весь decellularization процедуры при холодной температуре (4 ° C), поскольку это будет препятствовать действие экзокринной ферментов, что освобождение от экзокринной клеток поджелудочной железы. Экзокринной ферментов, когда не тормозится, может вызвать вредное воздействие на клетки и ECM, как они могут переварить мембраны клетки и белки12. Как эффективно замораживания и оттаивания может лопнуть клетки, мы включили замораживания/оттаивания шаг, первоначально даже до перфузии моющих средств4,13. Первоначальный мыть после оттаивания будет удалить остатки клеток очередей. Моющим средством лечения, которые мы использовали представляет собой смесь SDC и X-100 Тритон на необычно высокие концентрации и скорости высокой перфузии. Мы выбрали этот подход для достижения быстрее decellularization, удалив экзокринной клетки, которые повреждают ECM. Мы предположить, что жесткий и быстрый протокол выгодно для decellularization поджелудочной железы, как меньше времени будет доступна для панкреатических ферментов взаимодействовать с ECM, таким образом, сохраняя хорошее компоненты ECM. Чтобы сохранить компоненты ECM, мы также добавили сериновые протеазы ингибитора (PMSF) к моющим средством решения, как это будет препятствовать активации ферментов, выпустили из клетки экзокринной14. Азид натрия добавляются все decellularization решения, как он действует как бактериостатическое агент, тем самым препятствуя вероятность бактериального загрязнения15.
Поджелудочной железы decellularized после этого протокола, показали сохранение ECM структур и ECM белков коллагена и эластина. Однако значительная потеря гликозаминогликанов была замечена в decellularized поджелудочной железы. Поджелудочной железы decellularized таким образом, также показали обещание для крепления человеческого плода стволовых клеток поджелудочной железы и выражение эндокринной и экзокринной маркеров в recellularized за 14 дней12штук. Однако чтобы генерировать нетронутыми и функциональных поджелудочной железы, дальнейшие исследования требуется в оценке правильные ячейки источники, типы клеток, клеток посева стратегии и биореактор культуры.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано грант от шведского правительства Альф LUA для Ш.С.Х
Materials
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
Referências
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
- Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).
- Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
- Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).
- Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
- Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
- Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
- Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).
