Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

Biomassa vegetal constitui a base de praticamente todos os alimentos terrestres-teias. Plantas adquirem elementos nutritivos do solo através de seus sistemas de raízes e utilizam a luz solar em seus tecidos foliares para sintetizar biomoléculas. Em particular, carbono e nitrogênio são usados para criar os carboidratos, proteínas (compostos de aminoácidos) e lipídios que são necessários para construir a biomassa de planta (Note-se que em plantas fisiologia “macronutrientes” o termo muitas vezes refere-se aos elementos do solo, tais como N, P, K e S, no entanto, ao longo deste trabalho este termo referiremos de biomoléculas, tais como proteínas, hidratos de carbono e lípidos). Quando herbívoros consomem material vegetal, os macronutrientes contidos nos tecidos da planta são discriminados em suas partes constituintes e usados para conduzir os processos fisiológicos do consumidor. Desta forma, macronutrientes de planta tem uma forte influência sobre a fisiologia do consumidor juntamente com implicações importantes para interações ecológicas de maior ordem e comida-web dinâmica.

Por todo o reino animal, a proteína solúvel e carboidratos digeríveis são os macronutrientes mais intimamente ligados à sobrevivência, reprodução e desempenho¹. Além disso, a maioria dos animais regula ativamente sua ingestão destes dois macronutrientes para atender suas demandas fisiológicas^1,2. Isto é particularmente verdadeiro para insetos herbívoros que detectar as concentrações de açúcares e aminoácidos em tecidos vegetais, que por sua vez direciona o comportamento alimentar. Como resultado, planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível tem desempenhado um papel forte na evolução das interações inseto-planta.

Enquanto dados na planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidratos digeríveis são relativamente raros (mas veja^{6,7,8,9,10,11}), há uma preponderância de dados disponíveis sobre conteúdo elementar de planta (carbono, nitrogênio e fósforo). Em grande parte, isso ocorre porque elementos desempenham um papel primordial na nutrição mineral de plantas a^3,4,5. Onde os elementos são medidos, correlações têm sido utilizadas para extrapolar a quantidade de proteína solúvel e carboidratos de fácil digestão, mas cálculos precisos são frequentemente difíceis de obter. Por exemplo, é impossível usar o carbono como um indicador do teor de carboidrato digerível planta porque carbono ubiquitously presente em todos os compostos orgânicos. Existe uma forte relação entre nitrogênio elemental e teor de proteínas solúveis de planta, e factores de conversão de nitrogênio-para-proteína generalizadas são frequentemente utilizados. No entanto, há fortes evidências de que as conversões de nitrogênio-para-proteína são altamente específicas^12,13,14,15, fazendo o uso de conversão generalizada provável imprecisas. Devido a isso, fatores de conversão de nitrogênio para proteína muitas vezes falta precisão, particularmente para a medida em que é necessária para estudos nutricionais em herbívoros. Além disso, a presença de N-contendo planta aleloquímicos, tais como alcaloides e Glicosinolatos que muitas vezes são tóxicos para herbívoros, pode confundir estas conversões.

Aqui, oferecemos dois ensaios químicos para medir a concentração de proteínas solúveis e carboidratos digeríveis em tecidos vegetais. Estes ensaios são apresentados separadamente, mas sugere-se que eles ser usados simultaneamente para analisar as mesmas amostras da planta para realizar uma análise mais abrangente de macronutrientes da planta. Ambos utilizam metodologias semelhantes, consistindo de uma etapa de extração, seguida de quantificação através de absorvância. Preparação de amostra de planta também é idêntica para ambos os protocolos, tornando mais fácil para executar ambas as análises em tandem. O utilitário destes ensaios não derivam de sua novidade, como eles dependem mais velhos, (Bradford, Jones, Dubois) ensaios colorimétricos bem-estabelecida^16,17,18, mas aqui nós organizaram uma clara e fácil de seguir protocolo que combina esses métodos com extração vegetal específico mais obscuras técnicas^17,19 a fim de fazer a aplicação destes ensaios mais acessível para aqueles em domínios relevantes para a planta.

Para ambos os ensaios, a planta macronutrientes primeiro são extraídos fisicamente pelo congelamento, liofilização, o material de planta de moagem. Para o ensaio de proteína solúvel, mais extração química é feita de^17,19 através de várias rodadas de utilização do Vortex e aquecimento de amostras em solução de NaOH. O bem conhecido ensaio de Bradford, utilizando G-250 azul brilhante de Coomassie, é usado para quantificar proteínas solúveis e polipeptídeos entre 3.000-5.000 Daltons^16,17. Este ensaio tem um alcance de deteção entre 1-20 µ g de proteínas totais por microplaca bem ou < 25 µ g/mL, mas não faz não medida ácidos amino livres. A etapa de extração do ensaio do carboidrato digerível é baseada no método de ácido diluído de Smith et al ²⁰ e permite o isolamento de açúcares solúveis, amido e fructosan – mas os carboidratos não estruturais. Um método de quantificação de ácido sulfúrico de fenol é tirado de Dubois et al . ¹⁸ e mede todos os mono-, oligo- e polissacarídeos (bem como derivados metil). Este ensaio é capaz de quantificar os açúcares específicos, mas aqui nós usá-lo como um indicador do teor de carboidrato digerível total (ver Smith et al. ²⁰ para análise mais detalhada). Juntos, estes ensaios medem os dois macronutrientes que são fortemente amarrados para plantar desempenho ecofisiologia e herbívoro, fornecendo dados importantes sobre a qualidade de recurso na base de teias de alimento terrestres. Apresentar estes protocolos promove a geração de datasets de macronutrientes de planta, a fim de obter uma compreensão mais profunda de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional herbívoro e interações planta-herbívoro.