Summary

Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino

Published: December 16, 2018
doi:

Summary

Adjunto, describimos un método para el aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de tejido ovárico canino.

Abstract

Interés en las células madre mesenquimales (MSCs) ha aumentado en la última década debido a su facilidad de aislamiento, expansión y cultura. Recientemente, estudios han demostrado la capacidad de diferenciación amplia que poseen estas células. El ovario representa a un candidato prometedor para las terapias basadas en células debido a que es rica en MSCs y con frecuencia se descarta después de cirugías de ovariectomía como residuos biológicos. Este artículo describe los procedimientos para el aislamiento, expansión, y la diferenciación de MSCs derivado de ovario canino, sin la necesidad de clasificación celular técnicas. Este protocolo representa una herramienta importante para la medicina regenerativa debido a la amplia aplicabilidad de estas células altamente diferenciables en ensayos clínicos y aplicaciones terapéuticas.

Introduction

El número de estudios publicados que enfoque en células madre ha aumentado sustancialmente en la última década, un esfuerzo de investigación que ha sido impulsado por el colectivo objetivo de descubrir terapias de Medicina Regenerativa de gran alcance. Las células madre tienen dos marcadores definición primarios: auto renovación y diferenciación. Las células madre mesenquimales son responsables de la facturación de tejido regular y tienen una capacidad más limitada de la diferenciación en comparación con las células madre embrionarias1. Recientemente, muchos estudios han demostrado una amplia gama de la diferenciación de MSCs y un tema en discusión es si existen diferencias entre las células madre embrionarias y adultas en todos los2.

El epitelio superficial de ovarium es una sin compromiso capa de células, relativamente menos diferenciada, que expresa ambos marcadores epiteliales y mesenquimales3, conservando la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células en respuesta a señales ambientales4. La ubicación exacta de las células madre en el ovario no es conocida; sin embargo, se ha propuesto que bipotential progenitores en la túnica albugínea dan lugar a las células germinales5. Estudios inmunológicos han presumido que estas células tienen un origen estromal6 o se encuentra en o próximo a la superficie del ovario7. Puesto que las células madre mesenquimales expresa numerosos receptores que desempeñan un papel importante en la adherencia de la célula8, fue diseñado un experimento para probar la hipótesis de que la selección de una población de células con una rápida adhesión aislaría a una población de células claramente caracterizables como mesenquimales en la naturaleza. Recientemente, nuestro grupo reportó la derivación de MSCs del tejido ovárico basado en su capacidad de adherencia a la superficie de plástico de la placa de cultivo en las primeras 3 h de la cultura, con el fin de obtener una población purificada de células exhibe adherencia rápida9. Aquí, describimos el método desarrollado para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido ovárico.

Protocol

Este experimento fue realizado con los ovarios de cuatro perras mestizo donados después de la cirugía electiva en un programa de esterilización canina. Este experimento fue aprobado por el Comité de ética en el uso de animales de la UNESP-FCAV (Protocolo nº 026991/13). 1. experimental Preparación Preparar o comprar 500 mL estéril de Dulbecco tamponada con fosfato solución salina (DPBS) sin calcio ni magnesio. Preparar una colagenasa stock solución mezclando 40 μg…

Representative Results

Aislamiento de células madre mesenquimales de ovario canino: El procedimiento de aislamiento de MSC ovárico se resume en la figura 1. Después de la cirugía, tejido picado, digestión de la colagenasa y un cambio de los medios de comunicación 3 h después del inicio de la cultura, una supuesta población de MSC con propiedades de plástico adhesivo rápidos fue …

Discussion

Aquí proporcionamos evidencia que MSCs pueden ser aislados del tejido ovárico canino, que se considera residuos biológicos después de la ovariectomía. Debido a que muchos tipos de células pueden encontrarse en el ovario, propusimos un protocolo para seleccionar MSCs en su rápida adhesión al plástico, que selecciona con éxito células que crecieron en una monocapa con una morfología de fibroblasto-como base.

El primer informe de la derivación de MSCs de médula ósea se basa en la c…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen el programa de esterilización canina en la UNESP-FCAV por proporcionar amablemente los ovarios. Este trabajo fue financiado por becas del FAPESP (proceso nº 2013/14293-0) y capas.

Materials

DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

Referências

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

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Citar este artigo
Hill, A. B., Hill, J. E., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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