הפרוטוקולים ללמוד את הכריכה של קטיונים זהב (Au(III)) כדי הייצורים החיים השונים של אלבומין שור (BSA), כמו גם אפיון הסתגלותי התלויים את ייחודי BSA-Au פלורסצנטיות מוצגים.
המטרה של הפרוטוקולים הציג היא ללמוד את התהליך של Au(III) מחייב BSA, מניב פלואורסצנטי אדום הנוצרות על-ידי שינוי קונפורמציה (λem = 640 ננומטר) של מתחמי BSA-Au(III). השיטה מתאימה את ה-pH להראות כי הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא מתואם עם מעברים pH-induced שיווי משקל של הצורות BSA. קומפלקסים BSA-Au(III) ניאון אדום יכול להיווצר רק עם התאמה של pH או שמעליו 9.7, המתאים קונפורמציה “-טופס” BSA. פרוטוקול כדי להתאים את BSA ליחס טוחנת Au וכדי לפקח הקורס-הזמן של התהליך של איגוד Au(III) מתואר. המספר המינימלי של Au(III) לכל BSA, כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום, הוא פחות מ 7. אנו מתארים את הפרוטוקול בשלבים כדי להמחיש את הנוכחות של מספר אתרי קישור Au(III) ב- BSA. הראשון, על-ידי הוספת נחושת (Cu(II)) או ניקל (קטיונים Ni(II)) ואחריו Au(III), שיטה זו מגלה אתר איגוד עבור Au(III) זה לא fluorophore אדום. שנית, על ידי שינוי BSA מאת תיול מיצוי סוכנים, מתגלה אתר איגוד Au(III) להיוות nonfluorophore אחר. שלישית, שינוי קונפורמציה של BSA על ידי ביקוע וכיסוי מכבלי דיסולפידי, מומחשים את האתר של איגוד Au(III) אפשרי. הפרוטוקול המתואר, כדי לשלוט BSA הייצורים החיים מחייב Au(III), ניתן להחיל כלל ללמוד את האינטראקציות של האחר חלבונים ו קטיונים מתכת.
תרכובת BSA-Au בתערוכה של אולטרה סגול (UV)-טמפרמנט פלואורסצנטי אדום, עם יוצא מן הכלל סטוקס shift, יש להיות מסונתז במקור מאת Xie ואח. 1. פלואורסצנטי אדום ייחודי ויציבה יכול למצוא יישומים שונים בתחומים כגון חישה2,3,4,5,6,7הדמיה או ננו-רפואה8 ,9,10,11,12,13. תרכובת זו נחקרה בהרחבה על ידי חוקרים רבים בתחום של ננו-מדע בשנים האחרונות14,15,16. המתחם BSA-Au פירשו Au25 nanoclusters. מטרת השיטה הציג היא לבחון את תרכובת זו בפירוט וכדי להבין ממה פלואורסצנטי אדום. לפי הגישה שהוצגו, הנוכחות של אתרים מרובים Au מחייבת, ומקור פלורסצנטיות, תחליף התגרענות יחיד-האתר של Au25 nanoclusters, ניתן לתיאור. אותה גישה יכול להיות מועסק כדי ללמוד איך אחרים חלבונים17,18,19 ומורכבת עם Au(III) יכול לשנות את המאפיינים פלורסנט פנימי שלהם.
הסינתזה של המתחם BSA-Au אדום-פלורסנט מחייבת פקד הצרים של היחסים טוחנת של BSA כדי Au (BSA:Au) על מנת למקסם את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ואת המיקום של הפסגות עירור פליטה מפה (EEM)20. ניתן להראות כי מספר אתרי קישור קיים עבור Au(III) לאגד, כולל קטע אספרגין (או Asp שבר, שאריות חומצה אמינית ארבע הראשונות ב- N-הסופית של BSA)21,22. חומצת אמינוth 34 ביותר של BSA (Cys-34) מוצג גם לתאם Au(III), להיות מעורב המנגנון של ה fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) אדום20. על ביקוע כל Cys-Cys קשרי דיסולפידי וכיסוי כל זריחה תיולים, אדום אינו מיוצר ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). אפשרות זו מציינת בצורך של Cys-Cys דיסולפידי חוב כמו האתר של איגוד Au(III) כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום.
טכניקות הכימיה חלבון לא היה בשימוש נרחב כדי ללמוד את מתחמי BSA-Au(III) בקהילה ננו-מדע. עם זאת, זה יהיה יקר להעסיק את הטכניקות הללו כדי להבין היבטים מסוימים של אלה מתחמי, כמו גם כדי להשיג הבנה מפורט של האתרים מחייב Au(III) BSA. מאמר זה נועד להראות כמה טכניקות אלה.
תרכובות BSA-Au(III) מוכן ב- pH 12 מפגינים פלואורסצנטי אדום-גל פליטה של λem= 640 nm כשהוא מתרגש עם אולטרה סגול (UV) λ אורex= 365 nm (איור 1 א’). הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא תהליך איטי ואת ייקח כמה ימים בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את העוצמה המקסימלית. מפעיל את התגובה ב 37 מעלות צל…
The authors have nothing to disclose.
S.E. מאשר התמיכה של הדוכס ביקורים יוזמה מיוחדת, וולס פארגו קרן, קרן חברת פארמה, כמו גם קרנות הפעלה מ מאוניברסיטת צפון קרוליינה, שרלוט.
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |