Formation de luminophore dans différentes Conformations de l’albumine sérique Bovine en se liant d’or
Summary
Les protocoles pour l’étude de la liaison des cations or (Au(III)) à différentes conformations de l’albumine sérique bovine (BSA) ainsi que pour caractériser la fluorescence dépendante conformationnelle de la BSA-Au unique sont présentées.
Abstract
Les protocoles présentés vise à étudier le processus de liaison d’au (III) à BSA, rendement de fluorescence rouge induite par le changement de conformation (λem = 640 nm) des BSA-Au(III) complexes. La méthode permet d’ajuster le pH pour montrer que l’émergence de la fluorescence rouge est en corrélation avec les transitions d’équilibre induite par le pH des conformations BSA. Rouge fluorescent BSA-Au(III) complexes peuvent seulement être formés avec un ajustement du pH égale ou supérieure à 9,7, qui correspond à la conformation « A-form » de BSA. Le protocole d’ajuster la BSA au rapport molaire Au et de suivre l’évolution temporelle du processus de liaison d’au (III) est décrit. Le nombre minimal d’au (III) par BSA, à produire la fluorescence rouge, est inférieur à sept. Les auteurs décrivent le protocole en étapes pour illustrer la présence de plusieurs sites de fixation d’au (III) dans le BSA. Tout d’abord, par l’ajout de cuivre (Cu(II)) ou nickel (Ni(II)) cations suivies d’au (III), cette méthode révèle un site de liaison au (III) qui n’est pas le fluorophore rouge. Deuxièmement, en modifiant les BSA de thiol des agents de recouvrement, un autre site de liaison au (III) formant des nonfluorophore se révèle. En troisième lieu, les lieux possibles de liaison au (III) modifier la conformation de BSA par clivage et bouchage des liaisons disulfide, sont illustrées. Le protocole décrit, pour contrôler les conformations de la BSA et la liaison d’au (III), peut être généralement appliqué pour étudier les interactions entre d’autres protéines et les cations métalliques.
Introduction
Un BSA-Au composé présentant un rayonnement ultraviolet (UV)-excitable fluorescence rouge, avec remarquables déplacement de stokes, a été initialement synthétisé par Xie et al. 1. la fluorescence rouge unique et stable peut trouver diverses applications dans des domaines tels que la détection de2,3,4,5,6,7d’imagerie ou nanomédecine8 ,9,10,11,12,13. Ce composé a été étudié abondamment par de nombreux chercheurs dans le domaine des nano-sciences dans ces dernières années14,15,16. Le composé de BSA-UA a été interprété comme UA25 nanoclusters. L’objectif de la méthode présentée est d’examiner ce composé en détail et de comprendre l’origine de la fluorescence rouge. En suivant l’approche présentée, la présence de multiples sites de liaison Au et l’origine de la fluorescence, alternative à la nucléation de site unique d’UA25 nanoclusters, peuvent être illustrées. La même approche peut être utilisée pour étudier comment les autres protéines17,18,19 complexé au (III) peut changer leurs propriétés fluorescentes.
La synthèse du composé fluorescent rouge BSA-Au requiert un contrôle étroit des rapports molaires de BSA à UA (BSA:Au) afin de maximiser l’intensité de la fluorescence et la localisation des pics dans l’excitation-émission carte (EEM)20. Il peut être démontré que plusieurs sites de fixation existent pour au (III) lier, y compris le fragment de l’Asparagine (ou fragment de l’Asp, les quatre premiers résidus d’acides aminés à l’extrémité N-terminale de BSA)21,22. L’acide aminé le 34ème de BSA (Cys-34) montre aussi de coordonner au (III) et d’être impliquée dans le mécanisme de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rouge20. Dès coupant tous les ponts disulfures Cys-Cys et couvrant tous les fluorescence de thiols, rouge n’est pas produite ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Cela indique la nécessité de liaisons disulfide Cys-Cys comme le site de liaison au (III) pour produire la fluorescence rouge.
Techniques de chimie des protéines n’ont pas été couramment pour étudier les complexes BSA-Au(III) dans la communauté des nano-sciences. Toutefois, il serait utile d’employer ces techniques pour comprendre certains aspects de ces complexes, aussi bien quant à détaillée comprendre les sites de fixation d’au (III) dans la BSA. Cet article est destiné à montrer certaines de ces techniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les composés de BSA-Au(III) préparés à pH 12 présentent une fluorescence rouge à une longueur d’onde d’émission de λem= 640 nm lorsqu’il est excité avec rayonnement ultraviolet (UV) légère λex= 365 nm (Figure 1 a). L’émergence de la fluorescence rouge est un processus lent et prendra quelques jours à température ambiante pour passer à une intensité maximale. À 37 ° C en cours d’exécution de la réaction produira les résultats opti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. reconnaît l’appui du Fonds d’Initiative spéciale Duke Endowment, Wells Fargo fonds, Fondation de PhRMA, ainsi que des fonds de démarrage de l’University of North Carolina, Charlotte.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
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