Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

La identificación de elementos reguladores de expresión génica se ha facilitado por el proyecto de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE) que comprensivo había anotado actividad funcional para el 80% del genoma humano^1,2. La identificación de los sitios en vivo Unión de factor de transcripción, hipersensibilidad al DNaseI, y epigenético histona modificaciones de metilación del ADN en tipos de células individuales allanó el camino para el análisis funcional del candidato regulatorio elementos para la expresión del gen objetivo. Armado con estos resultados, nos enfrentamos con el desafío de determinar la interconexión funcional entre elementos reguladores y genes. Específicamente, ¿cuál es la relación entre un gen dada y su enhancer(s)? El método de captura (3C) de conformación de la cromatina aborda directamente esta cuestión por la identificación físicas y probablemente funcionales, las interacciones entre una región de interés y candidato interactuando secuencias a través de eventos capturados en cromatina fija³ . Como nuestra comprensión de las interacciones de la cromatina ha aumentado, sin embargo, es claro que la investigación de los lugares geométricos del candidato preseleccionado es insuficiente para proporcionar una comprensión completa de las interacciones del gene enhancer. Por ejemplo, codificar utiliza el método de copia (C 5) conformación cromosómica de alto rendimiento captura para examinar una pequeña parte del genoma humano (1%, piloto de 44 loci) y reportó la compleja interconexión de los loci. Genes y potenciadores con interacciones identificadas un promedio de 2 – 4 socios interactúan diferentes, muchos de los cuales fueron cientos de kilobases lejos en el espacio lineal⁴. Además, Li et al. utilizado el análisis de interacción de cromatina por Paired-End etiqueta secuenciación (ChIA-PET) para analizar las interacciones promotor de todo el genoma y encontró que 65% de los sitios de Unión II de ARN polimerasa estuvieron implicado en las interacciones de la cromatina. Algunas de estas interacciones dio como resultado grandes, genes múltiples complejos que abarcan cientos de kilobases de distancia genómica y que contiene, en promedio, 8-9 genes cada⁵. Juntos, estos resultados destacan la necesidad de métodos imparciales de todo el genoma para interrogar a las interacciones de la cromatina. Algunos de estos métodos se revisan en Schmitt et al. ⁶.

Métodos más recientes para los estudios de captura de conformación de la cromatina junto con generación de secuenciación (Hi-C y C 4-seq) permiten el descubrimiento de secuencias desconocidas interactuando con una región de interés⁶. Específicamente, captura de conformación circular cromosoma con secuenciación de próxima generación (4C-seq) fue desarrollado para identificar loci interactuando con una secuencia de interés en una manera imparcial⁷ mediante la secuenciación de ADN de cromatina capturada proximal a la región de interés en el espacio 3D. Brevemente, la cromatina se fija para preservar sus interacciones proteína-ADN nativo, troceados con una enzima de la restricción y posteriormente ligarse en condiciones diluidas captura biológicamente relevantes “enredos” de loci interactuantes (figura 1). Los enlaces cruzados se invierten para quitar la proteína, quedando así el ADN disponible para escote adicional con una segunda enzima de restricción. Una ligadura final genera círculos más pequeños de loci interactuando. Cartillas para la secuencia de interés entonces se utilizan para generar una biblioteca amplificada de secuencias desconocidas de los fragmentos circular, seguidos por la secuencia de generación siguiente aguas abajo.

El protocolo presentado aquí, que se centra en la preparación de la muestra, hace dos alteraciones principales existentes 4C-seq métodos^8,9,10,11,12. En primer lugar, utiliza un método basado en qPCR empíricamente determinar el número óptimo de amplificación ciclos para pasos de preparación de biblioteca C 4-seq y así mitiga el potencial sesgo de PCR de amplificación excesiva de las bibliotecas. En segundo lugar, utiliza un paso de recopilación de restricción adicionales en un esfuerzo para reducir la uniformidad de secuencias conocidas de “cebo” que impide precisa base llamada por el instrumento de la secuencia y, por lo tanto, maximiza la secuencia informativa, única en cada lectura. Otros protocolos de eluden esta cuestión poniendo en muchas bibliotecas de (12-15)⁸ 4 C-seq con cebo diferentes secuencias o sitios de restricción, un volumen de experimentos que no sean alcanzables por otros laboratorios. Las modificaciones aquí presentadas permiten un pequeño número de experimentos, las muestras o repeticiones para ser indexadas y agrupados en un solo carril.