차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처
Summary
유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.
Abstract
주어진된 대상 유전자에 대 한 규제 요소 식별 규제 요소 대상 유전자의 위치 및 효과 크기 가변성 때문는 상당한 기술에 도전 포즈. 존재의 bioinformatic 예측 및 보존된 전사 인자 바인딩 사이트를 사용 하 여 활성화 된 유전자 발현과 관련 된 근 후 성적인 수정의 기능 일부 진행이 했다. Chromatin 구조 캡처 연구 실제 chromatin 연락처 시퀀스 사이 고 심지어는 전체 게놈 안에서 발견 하는 우리의 능력을 혁명 있다. 원형 chromatin 구조 캡처 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq)과 함께 특히, 설계 관심 (관점)의 특정된 시퀀스에 대 한 가능한 모든 물리적 chromatin 상호 작용 발견 대상 유전자 또는 규제 등 증강입니다. 현재 4 C-seq 전략 직접 관점 내에서 시퀀스 하지만 수많은 요구와 동시에 유니폼의 기술 문제를 피하기 위해 시퀀스 수를 다양 한 관점 다음 세대 시퀀싱 플랫폼 호출 (영상) 기지. 실험의이 볼륨 많은 실험실에 대 한 실용적 되지 않을 수 있습니다. 여기, 우리는 추가 금지 효소 다이제스트 및 가능성을 완화 하 고 다양 한 시퀀스 읽기의 큰 캡처를 용이 하 게 설계 된 정량 기반 증폭 단계 통합 4 C-seq 프로토콜 수정된 접근 보고 PCR 편견, 각각. 우리의 수정 4 C 방법은 의무가 chromatin 아키텍처를 평가 하기 위한 표준 분자 생물학 실험실입니다.
Introduction
유전자 발현에 대 한 규제 요소의 id 인간 게놈1,2의 80% 기능 활동을 포괄적으로 주석 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 프로젝트에 의해 촉진 되었습니다. 녹음 방송 요인 바인딩 vivo에서 , DNaseI 과민성 및 epigenetic 히스톤 DNA 메 틸 화 수정 개별 셀에 대 한 사이트의 식별 후보 규제의 기능 분석에 대 한 방법을 포장 대상 유전자 발현에 대 한 요소입니다. 이러한 결과와 무장, 우리 규제 요소와 유전자 간의 기능 상호 결정의 도전으로 직면 된다. 특히, 주어진된 대상 유전자와 그것의 enhancer(s) 사이 관계는 무엇 인가? 염색 질 구조 캡처 (3 C) 메서드는 직접 식별 물리적, 그리고 가능성이 기능, 상호 작용을 통해 관심 영역 및 시퀀스 고정된 chromatin3에에서 캡처된 이벤트를 통해 상호 작용 하는 후보 사이이 질문을 해결 . 그러나 Chromatin의 상호 작용에 대 한 우리의 이해 증가로, 그것은 분명 미리 후보 loci의 조사 유전자 증강 상호 작용의 완전 한 이해를 제공 하는 부족 한 것입니다. 예를 들어 인코딩 높은 처리량 염색체 구조 캡처 탄소 복사 (5 C) 방법을 사용 하는 인간 게놈 (1%, 파일럿 44 loci의 설정)의 작은 부분을 검사 하 고 보고는 loci의 복잡 한 상호. 유전자와 확인 된 상호 강화 평균 2-4 다른 상호 작용 파트너는 많은 수백 kilobases 선형 공간4에서 멀리 했다. 또한, 리튬은 외. 전체 게놈 발기인 상호 작용을 분석 하 여 RNA 중 합 효소 II 바인딩 사이트의 65 %chromatin 상호 작용에 참여 했다 발견 Chromatin 상호 작용 분석 쌍 끝 태그 시퀀싱 (ChIA 애완 동물)를 사용. 이러한 상호 작용 중 일부 결과 kilobases 게놈 거리 및 포함 하는, 평균,의 수백에 걸쳐 큰, 다중 유전자 복합물에 8-9 유전자 각5. 함께,이 발견 심문 chromatin 상호 작용에 대 한 편견된 전체 게놈 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 슈미트 외에 이러한 방법 중 일부를 검토 한다. 6.
Chromatin 구조 캡처 연구에 대 한 더 많은 최근 방법 관심6의 지역 상호 작용 하는 알 수 없는 시퀀스의 발견 다음-세대 시퀀싱 (Hi-C와 4 C-seq) 활성화와 결합. 특히, 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq) 원형 염색체 구조 캡처 loci 캡처된 chromatin에 인접에서 DNA 시퀀싱 하 여 공평한 방식으로7 의 시퀀스와 상호 작용을 식별 하기 위해 개발 되었다 합니다 3D 공간에 대 한 관심의 영역입니다. 간단히, chromatin의 기본 단백질 DNA 상호 작용, 제한 효소로 죽 습 및 상호 작용 loci (그림 1)의 생물학 관련 “엉 킴”을 잡으려고 희석 조건 이후 출혈을 보존 하기 위해 고정 됩니다. 따라서 두 번째 제한 효소로 DNA 분열을 추가 사용할 수 떠나는 단백질을 제거 하는 크로스 링크 반전 한다. 마지막 결 찰 상호 작용 loci의 작은 동그라미를 생성합니다. 관심사의 순서에 뇌관 다음 다운스트림 다음 세대 시퀀싱 다음 circularized 조각에서 알 수 없는 시퀀스의 증폭된 라이브러리를 생성 하는 데 사용 됩니다.
샘플 준비에 초점을 맞추고, 여기, 프로토콜은 기존 4 C-seq 방법8,9,10,,1112에 두 가지 주요 변경 합니다. 첫째, 정량 기반 메서드를 사용 하 여 실험적으로 결정 하 증폭의 최적의 수 4 C-seq 라이브러리 준비 단계 주기 따라서 PCR 바이어스 라이브러리-확대에서 형태소 분석에 대 한 가능성을 줄입니다. 둘째, 그것은 시퀀싱 악기에 의해 정확한 자료 호출을 방해 하 고, 따라서, 각 읽기에 독특한, 유익한 시퀀스를 극대화 하는 알려진된 “미끼” 시퀀스의 균일성을 줄이기 위해 노력에서 한 추가 제한 다이제스트 단계를 사용 합니다. 다른 프로토콜은 다른 미끼 시퀀스 또는 금지 사이트, 다른 실험실에 의해 달성 되지 않을 수 있습니다 실험의 많은 (12-15)8 4 C-seq 라이브러리를 풀링 하 여이 문제를 포위. 여기에 제시 된 수정 실험, 수가 적은 샘플, 또는 색인 풀링된 단일 차선으로 복제를 허용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
4 C 결과 공개 이전에 알려지지 않은 규제 요소를 식별할 수 있는 chromatin 상호 작용 및/또는 대상 유전자 특정 생물 학적 컨텍스트24,,2526중요 한 가능성이 있습니다. 그러나, 기술적인 장애물은이 실험에서 얻은 데이터를 제한할 수 있습니다. 4 C 프로토콜에 서식 파일의 이상 증폭에서 형태소 분석 PCR 바이어스가 높습니다. 이 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIAMS (R01AR065523)에 의해 지원 되었다.
Materials
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
Referências
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