Summary

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Published: August 15, 2018
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Summary

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Abstract

Tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione della salute peso e tutti i giorni. Ancora, esistono limitazioni significative ai modelli disponibili colture primarie, i quali hanno fallito fedelmente ricapitolare il microambiente adiposo o estendere la vitalità WAT oltre due settimane. La mancanza di un modello affidabile coltura primaria ostacola gravemente ricerca nel WAT metabolismo e lo sviluppo di farmaci. A tal fine abbiamo utilizzato gli standard di NIH di un sistema di microphysiologic per sviluppare una nuova piattaforma per coltura primaria WAT chiamato ‘SWAT’ (Sandwich tessuto adiposo bianco). Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di interposizione macinate WAT cluster tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromal. In questo costrutto, campioni WAT sono vitali oltre otto settimane nella cultura. SWAT mantiene l’ECM intatto, contatti cellula-cellula e pressioni fisiche delle condizioni in vivo WAT; Inoltre, SWAT mantiene un robusto profilo trascrizionale, sensibilità ai segnali chimici esogeni e funzione del tessuto intero. SWAT rappresenta un metodo semplice, riproducibile ed efficace della cultura adiposo primario. Potenzialmente, è una piattaforma ampiamente applicabile per la ricerca in fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e sviluppo farmaceutico WAT.

Introduction

Il tessuto adiposo è l’organo primario dell’obesità, che trasporta annuali costi medici diretti tra $ 147 miliardi e $ 210 miliardi a US1. L’accumulo di tessuto adiposo contribuisce anche ad altre cause conducenti della morte come malattie cardiache, diabete di tipo II e alcuni tipi di cancro2. Modelli di coltura in vitro sono essenziali per gli studi metabolici e lo sviluppo di farmaci, ma i modelli attuali di ricerca di tessuto adiposo hanno carenze principali. Adipociti sono fragile, capace di galleggiare e cellule che non aderiranno alla plastica di coltura delle cellule e pertanto non possono essere coltivate utilizzando metodi di coltura cellulare convenzionale terminalmente differenziano. Dal 1970, diversi metodi sono stati utilizzati nei tentativi di superare queste barriere, compreso l’uso di vetrini coprioggetti, soffitto cultura, coltura di sospensione e matrici extracellulari3,4,5, 6 , 7. Tuttavia, questi metodi sono stati segnati da cellule morte e dedifferenziazione e vengono in genere utilizzati per non più di un periodo di studio di due settimane. Inoltre, questi modelli non tentare ricapitolare il microambiente adiposo nativo come non mantengono intatto ECM, le interazioni tra adipociti e stromal cellule di supporto, né le cellule contrattili forze esercitano sulla vicenda in in vivo WAT.

In assenza di un metodo di cultura adiposa primaria oro-standard, ricerca adiposa si affida principalmente differenziati pre-adipociti (diffAds). DiffAds sono multilocular, aderente e metabolicamente attivo. Al contrario, primari adipociti bianchi sono unilocular, nonadherent e dimostrano relativamente basso metabolismo. Il fallimento degli attuali modelli di cultura adiposa di ricapitolare la fisiologia del tessuto adiposo maturo sano è probabilmente un fattore importante in assenza di farmaci approvati dalla FDA che incidono direttamente adipocytes. Infatti, la mancanza di modelli di organo fisiologico in vitro è un grave problema in tutta la maggior parte dei organi e malattia.

Nel suo documento di posizione che annuncia la creazione del suo programma di Microphysiological Systems (MPS), il National Institutes of Health (NIH) ha riferito che il tasso di successo 2013 attraverso tutti gli studi clinici farmaceutici umani era solo 18% per la fase II e 50% per la fase III studi clinici8. Il programma MPS è progettato per affrontare direttamente l’incapacità di monocoltura in vitro di fisiologia umana modello. Il NIH definisce MPSs come sistemi di coltura composto umano primario o cellule staminali in costrutti 3D multicellulari che ricapitolano il funzionamento dell’organo. A differenza dei modelli riduzionisti di colture cellulari immortalizzate, omogenea, MPSs dovrebbe modellano accuratamente cellula-cellula, cellula farmaco, farmaco-farmaco e organo-droga interazioni9. A differenza dei metodi di coltura primaria a breve termine, NIH standard impongono sostenibilità MPS per 4 settimane in cultura8. Ulteriori dettagli del programma MPS possono essere trovati alla RFAs (#RFA-TR-18-001)10 di NIH.

Abbiamo sviluppato un semplice, romanzo, adattabile, e poco costoso MPS adiposo definito “Sandwich tessuto adiposo bianco” (SWAT)11. Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di “sandwiching” macinato primario del tessuto adiposo tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromale (CSTA) (Figura 1). Il costrutto 3D risultante ricapitola il contatto cellula-cellula e il microambiente adiposo nativo circondando adipocytes maturi con una popolazione di cellule di supporto del adipocyte naturale. SWAT è stato convalidato da dimostrare 8-settimana sostenibilità, risposta alla segnalazione esogeno, secrezione di adipokine e attecchimento in un modello animale.

Protocol

Tutte le attività sono state effettuate in aderenza ai protocolli 8759 # e #9189, approvato dall’ufficio di LSUHSC-NO. IRB Tutto il lavoro animale è stato eseguito in aderenza al protocollo #3285 approvato dall’ufficio IACUC LSUHSC n. 1. semina di interposizione di strati delle cellule Nota: Vedere la Figura 1. CSTA seme al circa il 80% confluency in piastre di coltura tissutale (6cm o piastre da 6 pozzetti). Per ogni pozzet…

Representative Results

Attuabilità della SWAT inizialmente è stata valutata da formazione immagine seriale campo chiaro di singoli WAT cluster (n = 12) circa 7,6 settimane. Cluster è rimasto protetti in posto su monostrato in tutto questo tempo. Lievi cambiamenti morfologici sono stati osservati con singoli adipociti orditura leggermente o posizioni di spostamento. Tuttavia, adipociti né diventano multilocular nel corso del tempo, che indica una mancanza di dedifferentiation, né fatto essi presentano segni…

Discussion

Questo protocollo dettaglia l’uso di CSTA panino la maggior parte del tessuto adiposo umano bianco; linee cellulari umane di ADSC possono essere isolate tramite protocolli ben stabiliti15. Tuttavia, il sistema può essere adattato per esigenze di ricerca individualizzata (ad esempio utilizzando cellule di 3T3L-1 al mouse panino WAT). Questo processo comporta la manipolazione del tessuto umano primario. Precauzioni di sicurezza standard dovrebbero essere impiegati; gestire tessuti umani come agenti…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori si desidera ringraziare il supporto istituzionale fornito da LSU Health Sciences Center, che ha finanziato il progetto.

Materials

10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2µm Syringe Filter Celltreat 229747
5mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75°C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

Referências

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Citar este artigo
Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

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