Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker in volwassenen, is over het algemeen geassocieerd met een slechte prognose en schaarse efficiënte therapieën zijn voorgesteld in het afgelopen decennium. Onder de veelbelovende kandidaten voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën, cellulaire immuuntherapie zijn doelwit geweest om te elimineren zeer invasieve en chemo-radioresistant tumorcellen, waarschijnlijk betrokken in een snelle en dodelijke terugval van deze vorm van kanker. Dus, haveninterfaces van allogene GBM-reactieve immuun cel effectoren, zoals menselijke Vϒ9Vδ2 T-lymfocyten, in de nabijheid van de tumor zou Hiermee geeft u een unieke kans om het leveren van efficiënte en hooggeconcentreerde therapeutische agenten rechtstreeks in de site van hersenen maligniteiten. Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een preklinisch bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van deze cellulaire immuuntherapie die afhankelijk zijn van stereotactische injecties van allogene menselijke lymfocyten binnen intrabrain tumor bedden.
Introduction
GBM (die graad IV astrocytoom), is de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker bij volwassenen. GBM blijft ondanks agressieve behandelingen die een combinatie van chirurgie en radio-chemotherapie, gekoppeld aan een zeer slechte prognose (mediane overleving van 14,6 maanden en een 2-jaar-sterfte > 73%)1. Dit bewijzen dat gedurende de laatste tien jaar2paar efficiënte vooruitgang op therapeutische gebied zijn gevalideerd. Onder de kandidaten voor het ontwerp van meer effectieve therapeutische strategieën3,–4,5, worden immuuntherapie6 momenteel onderzocht om te volgen en te elimineren zeer invasieve en radio/chemo-resistant tumor cellen, verdacht voor hun belangrijke bijdrage aan de snelle en dodelijke tumor herval7. Diverse immunologische doelwit werden geïdentificeerd en voorgestelde voor immuuntherapie, waarbij natuurlijke of gewijzigde αβ of ϒδ T lymfocyten zoals GBM-specifieke tumor-antigenen of stress-geïnduceerde moleculen8,9, 10. De mogelijkheid tot het beheren van geselecteerde GBM-reactieve immuun cel effectoren vertegenwoordigt een unieke gelegenheid om verhoogde hoeveelheid effector lymfocyten leveren rechtstreeks op de site van residuele maligniteit. Ter ondersteuning van deze strategie, hebben wij onlangs aangetoond dat modellen op basis van immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic primaire menselijke GBM xenografts getrouw de ontwikkeling van hersentumoren in GBM-patiënten9,11 recapituleren. Deze modellen werden bovendien gebruikt om aan te tonen van de sterke antitumorale efficiëntie van adoptively overgedragen allogene menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten.
Dit protocol beschrijft de kritische experimentele stappen voor het bereiken van stereotactische immuuntherapie van hersentumoren, zoals GBM, gebaseerd op de adoptieve overdracht van allogene T-lymfocyten. Het artikel toont: (i) de amplificatie van therapeutische allogene immuun effector T lymfocyten, zoals menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten; (ii) de opstelling van deze effector T-lymfocyten voor injectie; (iii) de procedure voor de stereotactische administratie binnen de hersenen, in de buurt van de tumor. Dit artikel bevat ook inzicht in het gedrag van deze cellulaire effectoren na stereotactische injectie.
De hier gepresenteerde therapeutische benadering is gebaseerd op de injectie van 20 x 106 effector cellen per dosis voor elke brain tumor-dragende immunodeficiëntie muis. Een eerste in vitro uitbreiding stap is vereist voor de productie van grote hoeveelheden van immuuncellen. Dus, niet-specifieke cel uitbreidingen zijn uitgevoerd met behulp van phytohemagglutinin (PHA-L) en bestraalde cellen van allogene feeder: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van gezonde donoren en Epstein Barr Virus EBV-getransformeerd B-lymphoblastoid cel lijnen (BLCLs), door in vitro infectie met EBV-bevattende cultuur supernatant van de cellijn Hapalomys B95-8, in aanwezigheid van 1 µg/mL cyclosporin-A. PBMCs afgeleid
GBM-reactieve effector immuuncellen worden vergeleken en geselecteerd uit in vitro testen9. Deze effector cellen worden geactiveerd en gebruikt standaard protocollen, volgens hun aard (bijvoorbeeld, menselijke Vγ9Vδ2 T-lymfocyten9 of menselijke anti-herpes virus αβ T lymfocyten12) met een minimale zuiverheidsgraad van > 80%, als routinematig versterkt gecontroleerd door analyse van de cytometrische. De cel expansie procedure hieronder geldt voor de diverse menselijke lymfocyt deelverzamelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een adoptief overdracht van geselecteerde native of gemanipuleerde immuun effector cellen vertegenwoordigt een veelbelovende aanpak om efficiënt het behandelen van tumoren, zoals infiltratieve hersenen kanker, het verzorgen van de beperking van de reactivities tegen niet-getransformeerd cellen15, 16,17,18. Het centrale zenuwstelsel, die bestaat uit de hersenen, heeft echter een bijzondere imm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken het personeel van het universitair ziekenhuis dier faciliteit (UTE) van Nantes voor veeteelt en zorg, de cellulaire en tissular imaging core faciliteit van de Universiteit van Nantes (MicroPICell) voor de beeldvorming en de Cytometry faciliteit (Cytocell) vanuit Nantes voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) en het Europese ERA-Net Transcan2-consortium (Immunoglio). Het team wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dit werk werd gerealiseerd in het kader van de LabEX IGO en de IHU-Cesti programma’s, ondersteund door de nationale onderzoek bureau Investissements d’Avenir via de programma’s ANR-11-LABX-0016-01 en ANR-10-IBHU-005, respectievelijk. Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door Nantes Metropole en de regio Pays de la Loire. De auteurs bedanken Chirine Rafia voor het verstrekken van hulp bij het corrigeren van het manuscript.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
Referências
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet?. Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
