Summary

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.

Abstract

גליובלסטומה (GBM), סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ביותר אגרסיבי אצל מבוגרים, מזוהה בדרך כלל עם פרוגנוזה גרועה, טיפולים יעילים נדיר הוצעו במהלך העשור האחרון. בין המועמדים מבטיחה עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות מקוריות, immunotherapies הסלולר סומנו כמטרות לחסל פולשני ביותר, כימותרפיה-radioresistant תאים סרטניים, סביר מעורב התדרדרות מהירה, חמורה של סרטן זה. לפיכך, administration(s) של effectors תא החיסון GBM-תגובתי allogeneic, כמו לימפוציטים Vϒ9Vδ2 T האנושי, בסביבת הגידול מייצג הזדמנות ייחודית לספק יעיל, המרוכזת סוכני טיפולית ישירות לתוך אתר של גידולים ממאירים במוח. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק של פרה הוכחה הרעיון הכדאיות והן את היעילות antitumor של אלה immunotherapies הסלולר המסתמכים על זריקות סטיאוטטי של לימפוציטים אנושיים allogeneic בתוך intrabrain הגידול מיטות.

Introduction

GBM (מי כיתה אסטרוציטומה הרביעי), הוא סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ואגרסיבי ביותר אצל מבוגרים. למרות טיפולים אגרסיביים המשלבות ניתוח וכימותרפיה -רדיו, GBM נשאר משויך מאוד פרוגנוזה (חציון ההישרדות של 14.6 חודשים ו 2-בן-התמותה > 73%)1. זה עדויות כי יש מעט התקדמות טיפולית יעילה מאומתים מעל העשור האחרון2. בין המועמדים על עיצוב האתר של יעיל יותר אסטרטגיות טיפוליות3,4,5, immunotherapies6 נידונות כעת לאתר ולחסל גידול פולשני ו רדיו/כימותרפיה-עמידים מאוד תאים, חשד על תרומתם מפתח גידול מהיר ולא קטלנית relapse7. אימונולוגי פוטנציאלים שונים היו מזוהה, המוצע עבור immunotherapies, מעורבים טבעי או αβ ששונו או לימפוציטים מסוג T ϒδ כגון GBM ספציפיים גידול אנטיגנים או מולקולות מפגינות8,9, 10. האפשרות לנהל שנבחרו effectors תא החיסון GBM-תגובתי מייצג הזדמנות ייחודית לספק כמויות מוגברות של לימפוציטים ישירות לתוך האתר של ממאירות שיורית. כדי לתמוך באסטרטגיה זו, לאחרונה הראינו כי מודלים בהתבסס על עכברים immunodeficient נושא xenografts orthotopic ראשי GBM האנושי בנאמנות מסכם את הדברים על התפתחות גידולים במוח ב- GBM חולים9,11. יתר על כן, מודלים אלה שימשו כדי להדגים את היעילות antitumor חזקה של לימפוציטים הועבר adoptively Vϒ9Vδ2T allogeneic אנושי.

פרוטוקול זה מתאר את השלבים ניסיוני קריטי להשגת סטיאוטטי immunotherapies של גידולים במוח, כגון GBM, המבוססת על העברת המאמצת של לימפוציטים מסוג T allogeneic. המאמר מציג: (i) ההגברה של טיפולית allogeneic המערכת החיסונית T לימפוציטים, כמו לימפוציטים אנושיים Vϒ9Vδ2T; (ii) הכנת אלה T לימפוציטים להזרקה; (iii) ההליך עבור ניהול סטיאוטטי בתוך המוח, ליד הגידול. מאמר זה גם מספק תובנה אופן הפעולה של אלה effectors הסלולר לאחר ההזרקה סטיאוטטי.

הגישה הטיפולית המובאת כאן מבוסס על ההזרקה של 20 x 106 אפקטור תאים לכל מנה עבור העכבר immunodeficient נושאות כל המוח. שלב ההרחבה הראשונית במבחנה נדרש לייצר כמויות גדולות של תאים חיסוניים. לכן, לא ספציפית תא הרחבות מבוצעות באמצעות phytohemagglutinin (PHA-L) וכן מוקרן allogeneic מזין תאים: תאים תאי הדם ההיקפית (PBMCs) מן התורמים בריא ותא טרנספורמציה-אפשטיין בר וירוס EBV B-lymphoblastoid קווים (BLCLs), הנגזר PBMCs על-ידי זיהום במבחנה המכילה EBV בתרבות supernatant משורת תאים מרמוסט B95-8, בנוכחות 1 µg/mL וציקלוספורין-א

תאים חיסוניים אפקטור GBM-תגובתי בהשוואה ונבחר במבחנה מבחני9. תאים אלה אפקטור מופעלים, הוגדל באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, על פי הטבע שלהם (למשל, אדם Vγ9Vδ2 T לימפוציטים9 או וירוס אנטי-הרפס אנושית αβ T לימפוציטים12) עם טוהר המינימלי של > 80%, כמו באופן שגרתי נבדק על ידי ניתוח cytometric. ההליך הרחבה תא שיפורטו להלן חל על קבוצות משנה לימפוציטים אנושיים שונים.

Protocol

הליך מעורבים בעלי חיים הנושאים הבאים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיים (הסכם #00186.02; ועדת האתיקה האזורי של פיי דה לה לואר [צרפת]). PBMCs האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש הדם שנאספו מתורמים בריאים מושכלת (Etablissement פרנקאיס du שרו נאנט, צרפת). כל הצעדים מבוצעים בתנאים סטריליים. 1. שאינם ספציפיים ה…

Representative Results

מחקר זה מתאר את האסטרטגיה של העברות המאמצת של תאים אפקטור מערכת החיסון התאית בתוך המוח של עכברים נושא הגידול, בהתבסס על זריקות סטיאוטטי שבוצעו ישירות בתוך המיטה הגידול. כדי למזער כל סיכון של פגיעה מוחית המשויך אמצעי הזרקה גדולים, התליה תא…

Discussion

העברה המאמצת של נבחרת מקורית או תאים מהונדסים אפקטור המערכת החיסונית מייצג גישה מבטיחה לטפל ביעילות גידולים, כגון סרטן המוח infiltrative, מטפלת הגבלת reactivities נגד תאים שאינם טרנספורמציה15, 16,17,18. עם זאת, מערכת העצבים המרכזית, המ…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים תודה הצוות של בית החולים האוניברסיטאי בעלי חיים המתקן (UTE) של נאנט על גידול בעלי חיים, טיפול הסלולר, tissular הדמיה מתקן הליבה של אוניברסיטת ננט (MicroPICell) עבור הדמיה, המתקן Cytometry (Cytocell) של נאנט לסיוע טכני מומחה שלהם. עבודה זו מומן על ידי INSERM CNRS, אוניברסיטת דה נאנט, Institut du הארצי לסרטן (האינקה #PLBio2014-155), le חדר מרווח וחדיש ליגה הלאומית לסרטן (AO InterRegional 2017), האיחוד האירופי עידן-Net Transcan2 (Immunoglio). הצוות ממומן על ידי Fondation pour la Medicale רשרש (DEQ20170839118). עבודה זו מומש בהקשר של LabEX IGO, התוכניות IHU-צ’סטי, נתמך על ידי Investissements סוכנות המחקר הלאומי d’Avenir באמצעות התוכניות ANR-11-LABX-0016-01 ו- ANR-10-IBHU-005, בהתאמה. הפרויקט IHU-צ’סטי נתמך גם על ידי נאנט Metropole ובאזור פיי דה לה לואר. המחברים מודים Chirine Rafia על מתן עזרה בתיקון כתב היד.

Materials

PBMCs from 3 different healthy donors
BLCLs from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) Gibco 31870-025
FCS Dutscher S1810-500
L-glutamine Gibco 25030-024
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
IL-2 Novartis proleukin
PHA-L Sigma L4144
Stereotaxic frame Stoelting Co. 51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame   Stoelting Co. 51624
microsyringe pump injector  WPI UMP3-4
NanoFil Syringe WPI NF34BV-2
NSG mice Charles River NSGSSFE07S
Ketamine Merial Imalgène 1000
Xylazine Bayer Rompur 2%
Scissors WPI 201758
Forceps WPI 501215
OmniDrill 115/230V WPI 503598
Vicryl 4-0 Ethicon VCP397H
Xylocaine Astrazeneca 3634461

Referências

  1. Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
  2. Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet?. Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
  3. Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
  4. Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
  5. Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
  6. Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
  7. Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
  8. Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  9. Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
  10. Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
  11. Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
  12. Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
  13. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
  14. Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
  15. June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  16. Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
  17. Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
  18. Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
  19. Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
  20. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  21. Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
  22. Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
  23. Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
  24. Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).

Play Video

Citar este artigo
Jarry, U., Joalland, N., Chauvin, C., Clemenceau, B., Pecqueur, C., Scotet, E. Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts. J. Vis. Exp. (139), e57870, doi:10.3791/57870 (2018).

View Video