Beta-cell funktionalitet är viktigt för blodglukos homeostas, som utvärderas med encelliga upplösning med en genetiskt kodade reporter för kalcium tillströmning.
Betaceller-svara på ökande blodglukosvärden genom att utsöndra hormonet insulin. Dysfunktion av beta-celler leder till hyperglykemi och svår, livshotande konsekvenser. Förstå hur beta-cellerna fungerar under fysiologiska betingelser och vilka genetiska och miljömässiga faktorer kan orsaka deras dysfunktion kan leda till bättre behandlingsalternativ för patienter med diabetes. Förmågan att mäta halter av kalcium i beta-celler fungerar som en viktig indikator på beta-cell-funktion, som inflödet av kalcium joner utlösare insulinfrisättning. Här beskriver vi ett protokoll för övervakning av glukos-stimulerad kalcium tillströmningen i zebrafiskar beta-celler med hjälp av GCaMP6s, en genetiskt kodade sensor av kalcium. Metoden tillåter övervakning av intracellulära kalcium dynamiken med encelliga upplösning i ex vivo monterad holmar. Glukos-lyhördheten för beta-celler inom samma Holmen kan fångas samtidigt under olika glukos koncentrationer, vilket tyder på förekomst av funktionella heterogenitet bland zebrafiskar beta-celler. Tekniken ger dessutom hög temporal och spatial upplösning, som avslöjar den oscillerande naturen av kalcium tillströmningen vid glukos stimulering. Vår strategi öppnar dörrarna för att använda zebrafiskar som en modell för att undersöka vilka genetiska och miljömässiga faktorer till beta-cell funktion och dysfunktion.
Våra blodglukossänkande upprätthålls inom ett snävt intervall, till stor del på grund av funktionen av endokrina bukspottkörteln. Den endokrina rollen i bukspottkörteln utförs av de Langerhanska öar, som innehåller hormon utsöndrar celler. Insulin-utsöndrar beta-cellerna är ansvariga för att sänka blodsockret efter en måltid som innehåller kolhydrater. Otillräcklig insulinutsöndringen från beta-cellen kan resultera i diabetes1, som kännetecknas av ihållande höga blod-glukos. Typ 1 och typ 2-Diabetes, som för närvarande drabbar mer än 400 miljoner människor i världen, leder till morbiditet och mortalitet2. Genom att undersöka de molekylära och miljömässiga faktorer som bidrar till beta-cell dysfunktion, förstår vi bättre hur typ 2-diabetes startar och fortskrider. Förmågan att skilja mänskliga stamceller till funktionella beta-celler in vitro- kan dessutom ge en källa till nya beta-celler för cell-ersättning terapier i typ 1-Diabetes. Därför är det viktigt att studera beta-cell funktion och mognad i genetiska modellorganismer för att få den nödvändiga kunskapen för att göra funktionella beta-celler i en maträtt.
Beta-cell funktionalitet kan övervakas på hela-holme nivå av kvantifiera den totala mängden insulin utsöndras som svar på glukos-stimulering. Denna kumulativa strategi studier Holmen som en enda grupp av celler utan att skilja cellens individuella egenskaper. Analysen av glukos svar av enskilda beta-celler visade emellertid en mångfald i betacellerna funktionella egenskaper och förekomsten av heterogenitet3. För att bedöma funktionen i enskilda beta-celler, är det möjligt att övervaka de intracellulära förändringar som leder till insulin sekretionen4. Insulinutsöndringen föregås av en post av glukos in i beta-cellerna. Den glukos som kommer in i beta-cellerna metaboliseras snabbt till ATP. Högre intracellulära ATP koncentrationerna minska öppen sannolikheten för ATP-känsliga kalium jonkanaler vilket leder till beta-cell depolarisation. Depolarisation öppnar spänningskänsliga kalcium jonkanaler och ökar intracellulär kalcium. I sin tur utlöser kalcium exocytos av insulin, som släpps i cirkulationen och sänker blodsockernivån genom att främja glukos-utnyttjande5,6,7.
Flera strategier har tillämpats för att undersöka funktionen av beta-celler, inklusive övervakning av membranet potential8, direkt visualisering av insulin-blåsor exocytos9och kvantifiering av intracellulära Ca2 + tillströmning som en proxy för glukos-lyhördhet10. Bland dem ger avbildning av intracellulära Ca2 + fördelen av up-scaling analysen till flera enskilda celler inom samma holme11,12, möjliggör direkt jämförelse av glukos-lyhördheten mellan enskilda beta-celler. Intracellulära Ca2 + koncentrationen kan övervakas med hjälp av kalcium-känsliga fluorescerande färgämnen13 eller genetiskt-kodade kalcium indikatorer (GECIs)14. Medan kalcium-indikator färgämnen brist celltyp specificitet, GECIs kan uttryckas i en viss celltyp av specifika initiativtagare. Dessutom ger den nya generationen av GECIs, såsom GCaMP6, bättre signal-brus-förhållande tillsammans med snabbare temporal dynamics15. Här beskriver vi nyttan av den nya generationen av GECIs, i särskilda GCaMP6s, att visualisera kalcium i beta-cellerna i encelliga upplösning. Vi tillämpa denna metod på zebrafiskar primära Holmen som vår modell av val. Under fosterutvecklingen, beta-celler i den primära islet härstammar från den dorsala och ventrala bukspottskörteln knoppar16. Den primära Holmen ligger vid en stereotypa anatomisk position inom zebrafiskar bukspottkörteln, möjliggör dess enkel identifiering och isolering. Beta-celler i den primära Holmen är nödvändiga för glukos-förordningen, eftersom deras genetiska ablation leder till hyperglykemi17,18. Dessutom blir dessa beta-celler glukos-lyhörd under tidig zebrafiskar utveckling19. Detta protokoll kan också tillämpas för imaging de sekundära holmar, som bildar under efter embryonala stadier. Protokollet tillåter att bilden betacellerna ex vivo, vid senare stadier av utveckling och under definierade glukos koncentrationer.
Här visar vi en teknik för kvantifiering av beta-cellen glukos lyhördhet encelliga upplösning. Detta möjliggörs genom att övervaka intracellulära kalciumkoncentration med hjälp av en indikator för genetiskt-kodade kalcium, GCaMP6s. Beta-cell aktivitet är tagna ex vivo genom att montera lilla i en fibrinogen-trombin mögel. Ett avgörande steg i protokollet är stabiliteten av mögel. Tillräcklig tid måste ges för fibrinogen att upplösa i HBSS lösningen. Utan detta, mögel inte polymerisera tillräckligt för att ge stabilitet under bildsession. En holme monterad i fibrinogen-trombin mögel och nedsänkt i cell kultur media kan förbli lönsamt för minst en vecka (inga data anges). Alternativ till fibrinogen-trombin mögel, såsom låg-melt agaros, kan utnyttjas för att montera den holme22. En annan viktig parameter är dissektion av Holmen. Under detta steg behöver vävnaden som omger lilla tas bort utan att skada eller peta Holmen. En skicklig dissektion kommer med praktiken.
En begränsning av protokollet imaging är begränsningen till en confocal plan av Holmen. Detta görs för att fånga dynamiken i kalcium tillströmningen inom enskilda beta-celler. En Z-stacken genom hela tjockleken på Holmen leder till låg imaging hastigheter och oscillerande signalförlust från enskilda celler. Denna begränsning kan förbättras med hjälp av snabbare transportmedel confocal-imaging såsom spinning-disk mikroskopi, aktivera fånga kalcium dynamiken i 3 dimensioner. En annan gräns skulle vara i vivo kalcium imaging12. Transparent beskaffenhet zebrafiskar embryo eller användning av pigment-mindre stammar av zebrafisk vuxna23 kunde öppna möjligheten i vivo imaging i framtiden.
Bildtagning av beta-cells aktivitet med hög rumsliga och temporal upplösning kan undersöka funktionella heterogenitet bland enskilda beta-celler. Denna strategi kan hjälpa till att belysa förekomsten av beta-cell delpopulationer. Nyligen har visat flera studier förekomsten av undergruppen av befolkningen i den nominellt homogen beta-celler24,25,26. Ex vivo imaging kan kombineras med genetiska reportrar att karakterisera sub-befolkningens svar till glukos. Dessutom kan kombinerar den imaging setup med farmakologisk stimulering tillåta för screening av föreningar som skulle kunna förbättra beta-cell funktionalitet.
Sammanfattningsvis tillåter den teknik som presenteras här kvantifiering och jämförelse av glukos lyhördheten för enskilda beta-celler. Det ger ett direkt fönster i beta-cellen funktionalitet, en viktig parameter i utvecklingen av diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar Ninov labbet för synpunkter på manuskriptet, medlemmar av Center för regenerativ terapier Dresden (CRTD) fisk och mikroskopi anläggning för tekniskt bistånd. N.N. stöds av medel från de DFG-CRTD, Cluster of Excellence vid TU-Dresden, tyska Research Foundation (DFG) och den tyska Center för Diabetes forskning (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |