ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Landesdirektion ザクセン, ドイツ (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016) の許可と動物福祉法による動物科目を含むすべてのプロシージャを承認されています。 1. 準備 メモ: このプロトコルは、ゼブラフィッシュ二重遺伝子導入 Tg から主膵島のex vivoイメージング (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP);Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 ゼブラフィッシュ。このトランスジェニック行でインスリン プロモーター (ins) ドライブ 2 つの遺伝子の β 細胞特異的発現: nls-Renilla-mKO2、単量体の Kusabira オレンジ 2 (mKO2) と β 細胞の核にあたる蛍光;GCaMP6s15 は、細胞内カルシウム水準の上昇への応答で緑色の蛍光を発する。GCaMP6s のベータ細胞特異表現は、周囲の細胞のタイプのカルシウム変化から干渉されることがなく β 細胞のグルコース応答性を検討できます。 1 ml の Ca2 +/Mg2 +牛フィブリノーゲンの 10 mg を溶解することにより新鮮なフィブリノーゲン株式 (10 mg/mL) の準備-ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 1.5 mL 遠心管中を含みます。渦フィブリノゲン粉末を完全に溶解するまで精力的に。少なくとも 15 分以上の室温でのソリューションを保持します。注: ソリューションは、重合を開始し、粘性になる場合、在庫は 2-3 在庫破棄のため室温で保存できます。 三重の HBSS フィブリノゲン株式を希釈してフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) を準備します。たとえば、フィブリノーゲン フィブリノーゲン実用的なソリューションの 900 μ L を準備する HBSS の 600 μ L 入荷の 300 μ L をミックスします。 10 を溶解することにより、トロンビン溶液 (10 U/mL) を準備 HBSS のリン酸 1 mL でトロンビンのユニット緩衝生理食塩水 (PBS)。注: このソリューション 50 μ L パーツで検体、予め用意でき-20 ° C の凍結 200 mM D グルコース溶液を準備するには、50 mL の水に D-グルコースの 1.8 g を溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。 300 mM KCl の解決策を準備するには、水 50 mL に KCl の 1.1 g 溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。 小島のマウント 35 mm 径ガラス底培養皿を調達します。 郭清と膵島の取り付けは、蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡を使用 (TRITC: 励起: 532-554 nm、発光: 570-613 nm; またはテキサス赤: 励起: 540-580 nm、発光: 592-667 nm)。 使用 (0.8 NA) X 20 倒立共焦点顕微鏡 (ツァイス LSM または類似の 780) 空気の目的および 35 mm 径ガラス底培養皿のプレート ホルダー装備 β 細胞内カルシウム流入のイメージングのため。 ゼブラフィッシュを安楽死させるため tricaine メタンのスルフォン酸塩 (MS222) の 200 mg/L 溶液を準備します。 ゼブラフィッシュ解離 90 mm シャーレを調達します。 2. ゼブラフィッシュ主膵島郭清と取付 MS222 で長期間加温を使用して魚を安楽死させます。このため、優しく漁網を使用して水槽から魚を削除し、蓋 (えら) の動きを示しています動物まで、MS222 ソリューションを含むペトリ皿でインキュベート通常、これにかかる 5 分含む Ca2 +/Mg2 +HBSS 液シャーレに転送魚。 蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡、下膵臓を分離する動物の腹部の右側にあるを覆っている皮膚を切り裂きます。 このため、シャープな鉗子を用いた臀鰭に口からゼブラフィッシュの皮膚をカットします。腹部を公開するカットの皮膚をはがすこの snipping 臓器の内部を公開します。Β 細胞の mKO2 式の赤い蛍光性を利用して、顕微鏡下で目視検査によって島の位置を確認します。必要な場合は、彼らは見つけるが難しく、膵島をカバーできるよう、肝臓の葉を削除します。注: 主な膵島は腹部、通常右側の前歯の近くにあります。 肝臓や脂肪細胞などの周囲の組織を慎重に外して主膵島をきれい。けがや膵島; を突くしないように予防措置を取る周囲の組織のクリアした後島表面の個々 の細胞は認識になります。 ガラス底皿の中央に HBSS の 30 μ L ドロップをピペットします。このドロップに切り裂かれたアイレットを転送します。 小島 HBSS で一度とフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) の 30 μ L を慎重に洗います。細胞死の結果をそう失敗のため洗浄のステップ中に膵島の乾燥を避けるためにことを確認します。 ゆっくりと優しく、トロンビン溶液 (10 U/mL) を 10 μ L を追加します。小島と皿は 15-20 分、フィブリノーゲン-トロンビン ドロップなる粘性とわずかに不透明なこの時点で観察のためそのままのままにします。 3 Ex Vivoでのゼブラフィッシュ プライマリ ランゲルハンス島における GCaMP の蛍光強度のライブ イメージング。 HBSS 金型上に 200 μ L を追加し、共焦点顕微鏡のプレート ホルダーに慎重に皿を置きます。共焦点レーザー顕微鏡の 20 倍、0.8 NA、航空目標を使用します。明視野観察オプションを使用して島を探します。 赤い蛍光性のフィルターを使用して、ベータ細胞の核 mKO2 蛍光を見る、小島に焦点を当てます。個々 の核がはっきりと見えるはずです。 手動で z 軸に沿って膵島の厚さを介して移動するために共焦点顕微鏡の焦点面を変更することによって明確な画像面を探します。画像平面 β 細胞イメージングのための十分な数 (50-100) を含んでいる、核 mKO2 蛍光の明るさは膵島の中心部で特に制服を確認します。 「スマート セットアップ メニュー」で次設定を使用して GCaMP6s と mKO2 蛍光の連続集録のセットアップ: GCaMP6s、励起: 488 nm、排出: 500-555 nm、偽色: 緑 (Select”GFP”);mKO2、励起: 561 nm (mCherry)、排出量: 570-630 nm、偽色: 赤 (選択”mCherry”)。注: この設定で、緑のチャネルは、GCaMP の蛍光強度を記録しながら、赤のチャネルによって β 細胞核の位置が記録されます。 「アクイジション ・ モード」で 1,024 x 1,024 ピクセルで画像の解像度を設定 10 と 1 で平均速度。開始連続記録「時系列」のオプションを選択して、1 フレームあたり約 2 秒捕捉時間と 500 サイクルの「期間」を設定します。注: タイム シリーズの最初の 50 のフレーム 5 mM のグルコース濃度で β 細胞の活動に対応します。これは、ベースラインの応答です。Β 細胞の応答時間で緑色の蛍光強度の満ち欠けが表示されます。我々 は、β 細胞の数 (1-5%) が 5 mM グルコースで振動することを観察しました。 イメージングのサイクルに目を離さない。最初の 50 フレーム後に、記録を停止せず 10 mm 周囲液のグルコース濃度を増やします。 画像取り込みを混乱させないでそっと 200 mm 膵島を保持してゲルの上に D-グルコース溶液 5 μ L をピペットします。10 mM グルコース 150 フレームを取得します。注: グルコース濃度の増加は、β 細胞の数を増加させる、緑のチャネルで GCaMP 蛍光振動を受けています。 細胞の核は、プロセス中には安定を確認します。小島が広く集録時に揺れていて、フォーカル プレーンのうち核に移動、(必要なら) サンプルを破棄します。 その後試料の安定性を確保するためにフィブリノーゲン-トロンビン金型の重合を有効にするのに十分な時間を待機します。 200 フレームでさらに軽く 200 mm D グルコース溶液 10 μ L をピペットで 20 mM に溶液の濃度を上げます。20 mM 濃度 150 フレームを取得します。 350 フレーム後 KCl の 30 ミリメートルを使用して島を脱分極します。このため、300 mM KCl 原液の 20 μ L を追加します。この段階で観察 GCaMP6s 蛍光振動を停止し、高強度の修正また β 細胞はグルコースに応じなかったことは、KCL の添加によってグリーン蛍光強度の増加を表示しました。 4. 個々 の β-細胞の GCaMP 蛍光トレースの定量化 注: トレースは、グルコースの様々 なレベルに個々 の β-細胞の応答を定量化、イメージング期間全体の GCaMP 蛍光強度を定量化します。数量は、携帯電話の解像度で実行されます。このためには、画像 (4.1-4.6 のステップ)、およびスプレッドシート ソフトウェアまたは R21分析 (4.8 から 4.9 の手順) を実行するから GCaMP の蛍光性の強度の値を抽出するフィジー20を使用します。 フィジー「LSM ツールボックス」を使用してイメージ ファイルを開きます。このため、選択”プラグイン |LSM ツールボックス |”LSM ツールボックスを表示します。「LSM ツールボックス」で”オープン LSM”をクリックし、イメージ ファイルを選択します。注:「LSM ツールボックス」でサポートされていない形式の tiff を分析のために最初にそれらを変換します。 フィジーの関心領域 (ROI) ツールを使用して細胞の応答を抽出します。「ツール」の下で「分析」メニューで「ROI マネージャー」を開きます。ツールバーにある「多角形選択ツール」を使用して投資収益率を手動で描画します。 ベータ細胞核が表示されます赤のチャネルに投資収益率を描画します。それは細胞の細胞質の一部を含めるためには細胞の核より大きい領域をカバーして、投資収益率を選択します。ROI 位置がフレーム間で一貫していることを確認し、必要に応じて位置を調整します。 「ROI マネージャー」に「[t] を追加する」ボタンをクリックしてして選択した Roi を追加します。選択し、複数のセルでデータを取得する投資収益率に複数 roi 結合相関を追加します。 次に、「解析」メニューから「測定を設定」を選択します。領域内の合計の蛍光強度の抽出を指定するためには、「集積密度」を選択します。 GCaMP 蛍光を含む緑のチャンネルに移り、「ROI マネージャー」で「マルチ メジャー」を選択。注: これは時間シリーズを通して細胞の強度の測定を提供します。 ROI 位置は膵島の動きのために調整する必要があります、場合に別のフレームで強度の測定を手動でコンパイルします。コピーして別のスプレッドシートに値を貼り付けます。 「LSM ツールボックス」からイメージ フレームのタイムスタンプを取得します。使用”スタンプを適用 |T スタンプを適用 |ファイル名 |ダンプ テキストファイルに”タイムスタンプを取得します。「として保存」オプションを使用してタイムスタンプを保存またはスプレッドシートにそれらをコピーします。 すべてのセルの強度値をコンパイル時に分析 1 つのセル、または自動的に (例えばExcel の数式または R を使用) を実行します。 2 つのステップの個々 のセルを分析します。 最初のステップで、ベースラインの上の蛍光強度を計算します。このため、最初の 50 フレーム (5 mM グルコース) の蛍光強度の平均として基準蛍光強度 (F0) を計算します。全体の時系列からベースライン (F0) を減算 (– F F0)。注: いくつかのセルは、通常高濃度で刺激を続けているクリアの GCaMP 振動基底グルコース下を表示できます。このような細胞の細胞が蛍光性の低下を示した初期フレームの平均強度を生かして F0を見積もることができるだけです。 分析の 2 番目のステップで蛍光強度を正規化することで最終的な GCaMP の蛍光強度を取得します。注: これは異なる動物から島の違いが削除されます。個々 の島は、グルコース刺激による蛍光発光のさまざまなレベルを表示します。 最高の強度値で割ることによって蛍光強度を標準化します。これ、ピーク強度 (F最大– F0) を算出し、最終的な GCaMP の蛍光強度を降伏するピーク強度の基準減算値の除算 (F – F0)/(F最大– F0)。 不健全なまたは破損しているかもしれないので変更を KCl 刺激強度に示さない細胞を破棄します。 R で分析 (4.9-4.10 の手順) を実行するため使用する R スクリプト (plotcelltrace。R) この原稿を提供しました。