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Genetics

भेदभाव, रखरखाव, और मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण: एक रोग BEST1 उत्परिवर्तनों के लिए एक डिश मॉडल में

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/57791
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

Summary

यहाँ हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं असर रोगी-प्राप्त उत्परिवर्तनों से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं अंतर करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. उत्परिवर्ती सेल लाइनों immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना सहित कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस रोग में एक डिश दृष्टिकोण देशी मानव RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने की कठिनाई को दरकिनार ।

Abstract

हालांकि मानव BEST1 जीन में २०० से अधिक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई है और रेटिना अपक्षयी रोगों से जुड़ा हुआ है, रोग तंत्र मुख्य रूप से BEST1 अध्ययन के लिए vivo मॉडल में एक अच्छा की कमी के कारण मायावी रह और शारीरिक स्थितियों के तहत अपने उत्परिवर्तनों । BEST1 encodes एक आयन चैनल, अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), जो रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में कार्य करता है; हालांकि, देशी मानव RPE कोशिकाओं के लिए अत्यंत सीमित पहुंच वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानव RPEs असर BEST1 रोग उत्पंन करने के लिए-मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से प्रेरित भेदभाव के कारण उत्परिवर्तनों । के रूप में hPSCs आत्म अक्षय हैं, इस दृष्टिकोण शोधकर्ताओं hPSC के एक स्थिर स्रोत के लिए विभिंन प्रायोगिक विश्लेषण के लिए RPEs, जैसे immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना है, और इस तरह एक बहुत शक्तिशाली रोग प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है एक डिश के लिए मॉडल BEST1-जुड़े रेटिना की स्थिति । विशेष रूप से, इस रणनीति RPE (पैथो) फिजियोलॉजी और ब्याज के अंय जीन natively RPE में व्यक्त अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

यह प्रलेखित किया गया है कि BEST1 जीन1,2,3,4,5,6 में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण कम से कम पांच रेटिना अपक्षयी रोग हैं , 7 , 8, पहले से ही २०० से अधिक की सूचना उत्परिवर्तनों की संख्या के साथ और अभी भी बढ़ रही है । इन BEST1-जुड़े रोगों, भी bestrophinopathies के रूप में जाना जाता है, प्रगतिशील दृष्टि हानि और भी अंधापन का कारण है, और वहां वर्तमान में कोई प्रभावी उपचार कर रहे हैं । BEST1के प्रोटीन उत्पाद अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), एक Ca2 +-सक्रिय सीएल चैनल (CaCC ) विशेष रूप से रेटिना वर्णक उपकला में व्यक्त (RPE) आंखों की5,6, 8,9. महत्वपूर्ण बात, BEST1-जुड़े रोगों के एक नैदानिक phenotype प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए कम दृश्य प्रतिक्रिया है, प्रकाश चोटी (एल. पी.) कहा जाता है electrooculogram में मापा10,11; एल. पी. RPE12,13,14में एक CaCC द्वारा मध्यस्थता माना जाता है. आदेश में बेहतर BEST1 उत्परिवर्तनों के रोग तंत्र को समझने के लिए और संभावित चिकित्सा के लिए काम करने के लिए, यह उत्परिवर्ती BEST1 चैनल endogenously मानव RPE कोशिकाओं में व्यक्त अध्ययन करने के लिए आवश्यक है ।

हालांकि, सीधे जीवित रोगियों से RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने के अत्यधिक अव्यावहारिक है । यद्यपि देशी RPE कोशिकाओं को मानव cadavers और भ्रूणों के बायोप्सी से काटा जा सकता है, इन स्रोतों के लिए कठिन पहुँच वैज्ञानिक अनुसंधान को काफी सीमित करता है. इसलिए, यह वैकल्पिक RPE मानव आंखों के अलावा अंय स्रोतों के लिए महत्वपूर्ण है । इस कॉल को स्टेम सेल तकनीक में हाल ही में प्रगति के द्वारा उत्तर दिया गया है, कार्यात्मक RPE कोशिकाओं के रूप में अब मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है (hPSCs), भ्रूण स्टेम सेल सहित (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), बाद 16,17,18दानदाताओं से प्राथमिक त्वचा fibroblasts reprogramminging द्वारा उत्पंन किया जा रहा है । महत्वपूर्ण बात, स्व-नवीकरण और hPSCs के pluripotency RPEs उत्पन्न करने के लिए एक विश्वसनीय स्रोत सुनिश्चित करते हैं, जबकि जीनोमिक की hiPSCs और hESCs संशोधन क्षमता के रोगी-विशिष्टता (जैसे, CRISPR द्वारा) एक बहुमुखी रोग के लिए एक डिश मॉडल की पेशकश इि BEST1 उत्परिवर्तन ।

hPSC-RPE चूहों RPE मॉडल पर कई फायदे हैं: 1) BEST1 नॉकआउट चूहों किसी भी रेटिना विषमता19प्रदर्शित नहीं करते हैं, चूहों और मनुष्यों के बीच BEST1 में RPE के विभिन्न आनुवंशिक आवश्यकता की संभावना स्थापना; 2) मानव RPE कोशिकाओं के केवल 3% binucleate हैं, चूहों में ३५% के विपरीत20; 3) hiPSC-RPE potentiates रेटिना विकारों के नैदानिक उपचार में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण21. फिर भी, पशु मॉडल एक जीवित प्रणाली में RPE फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अभी तक अपरिहार्य हैं, और hiPSC की oncogenic क्षमता की अनदेखी नहीं की जा सकती ।

प्रक्रिया यहां RPE भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक उपयोगी और मामूली सरल hPSC का वर्णन । इस प्रोटोकॉल nicotinamide (विटामिन B3) का उपयोग करता है तंत्रिका ऊतक, जो आगे activin के साथ उपचार द्वारा RPE में अंतर करने के लिए प्रेरित है के लिए hPSCs के भेदभाव को बढ़ाने के लिए । Nicotinamide उपचार pigmented कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है (RPE में भेदभाव का संकेत), संभवतः22कोशिकाओं अंतर की अपोप्तोटिक गतिविधि क्षीणन द्वारा. परिणामी hPSC-RPE कक्ष समान कुंजी मार्करों, cobblestone आकृति विज्ञान और सेलुलर कार्यक्षमता मूल मानव RPE कोशिकाओं22के रूप में प्रदर्शित करें । इस प्रकार, एक अनुसंधान की स्थापना में, जिसके परिणामस्वरूप hPSC-RPE कोशिकाओं immunoblotting, immunostaining सहित बहाव कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, और पूरे सेल पैच दबाना, जिसके लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं भी प्रदान की जाती हैं । नैदानिक, RPE कोशिकाओं स्टेम सेल से व्युत्पंन दोनों पशु अध्ययन और मानव परीक्षण23में धब्बेदार अध-पतन के प्रत्यारोपण उपचार के लिए महान क्षमता दिखाया गया है ।

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Protocol

1. RPE को hPSC का विभेद

  1. बनाए रखने और पारित hPSCs के रूप में पहले18वर्णित है ।
    नोट: (hPSCs और hPSC सहित सभी कोशिकाओं-RPEs) वृद्धि और भेदभाव प्रोटोकॉल की अवधि के दौरान 5% CO2 में ३७ ° c में उगाया जाता है ।
  2. भेदभाव करने से पहले, विभाजन धाराप्रवाह hPSCs पूर्व लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए ।
    1. कोट प्लेटें, गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बर्फ पर के बारे में 1 एच के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस DMEM मध्यम में एक 1:50 कमजोर पड़ने पर परिसमापन मैट्रिक्स को निलंबित, एक अच्छी तरह से ८०० µ एल कोटिंग मिश्रण जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए मशीन ।
    2. जब कोटिंग पूरी हो जाए, तो मिश्रण को महाप्राण और तुरंत कुएं में 1.5-2 मिलीलीटर मध्यम डालें ।
    3. पुरानी संस्कृति प्लेटों से hPSCs उठाने के लिए, पंजाब से अधिक ०.५ mM EDTA के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गर्मी, समाधान महाप्राण, और संस्कृति माध्यम के साथ छोटे झुरमुट में कोशिकाओं resuspend ।
    4. बीज कोशिकाओं पर ~ 20% नई प्लेटों में प्रवाह ।
      नोट: दुकान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में १०० µ l aliquots में-20 ° c और एक aliquot कोट करने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें । कोटिंग के लिए समय ३७ डिग्री सेल्सियस, या कमरे के तापमान पर रात भर में 4 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है निलंबित और बीज hPSCs के छोटे झुरमुट के रूप में 3-5 कोशिकाओं के बजाय एकल कोशिकाओं ।
  3. जब कोशिकाओं को पूर्ण प्रवाह करने के लिए बड़े हो रहे हैं, भेदभाव मध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह (4 मिलीलीटर/) (तालिका 1, बिना activin-A) । 14 दिनों के लिए संस्कृति, मध्यम बदलने (4 मिलीलीटर/) 3x/
    नोट: hPSC प्लेट घनत्व लगभग हर 24 घंटे युगल महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु विभेदक प्रक्रिया के शुरू होने के बाद की उंमीद है । मृत कोशिकाओं और कुओं में मलबे के समुच्चय मध्यम परिवर्तन के दौरान नग्न आंखों से देखा जा सकता है ।
  4. 15 दिन से 28 दिन के लिए, पूरक १०० एनजी/एमएल मानव activin के साथ अंतर मध्यम-एक (1 टेबल, मानव activin के साथ एक) । मध्यम बदलें (4 मिलीलीटर/) 3x/
  5. Stop activin-एक अनुपूरण 29 दिन पर शुरू (1 टेबल, मानव activin के बिना एक) । जारी रखें कक्ष संवर्धन के लिए भिंनता मध्यम में 8 – 10 सप्ताह तक pigmented hPSC-RPE क्लस्टर (चित्र 1a-B) दिखाई देते हैं ।
    नोट: pigmented कोशिकाओं के समूहों नग्न आंखों से एक सेल संस्कृति प्लेट पर छोटे काले डॉट्स के रूप में देखा जा सकता है (आंकड़ा 1a-बी, ऊपर). हस्ताक्षर cobblestone आकार के साथ व्यक्तिगत pigmented कोशिकाओं एक 20X माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है (आंकड़ा 1a-बी, नीचे).

2. अलगाव और विभेदित RPE कोशिकाओं की संस्कृति

  1. भेदभाव मध्यम निकालें, पंजाबियों के साथ एक बार धोने, एक अच्छी तरह से collagenase के ०.०५% trypsin प्लस 1 U/µ एल के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 20 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी-30 मिनट । trypsin/collagenase निकालें और धीरे से 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में पूर्व गर्म RPE माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें (< c0 > तालिका 2).
    नोट: hPSC-RPE कोशिकाओं, जो trypsin/collagenase उपचार से पहले बहुभुज रहे हैं की आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और पर्याप्त पाचन के बाद गोल हो जाते हैं ।
  2. कांच पाश्चर पिपेट खींचने के लिए एक Bunsen बर्नर का उपयोग करें ।
    1. दोनों हाथों के साथ, एक लंबी (9 इंच) पाश्चर पिपेट दोनों सिरों पर पकड़ तो यह क्षैतिज है, और पिपेट के पतले हिस्से की लंबाई नीचे 2/3 के बारे में Bunsen बर्नर के ऊपर ।
    2. एक बार गिलास लौ से नरम हो जाता है, जल्दी से दो सिरों के अलावा खींच, ऐसी है कि एक माइक्रो खुरचनी की तरह टिप पिपेट के नए अंत में गठन किया है (चित्रा 2) ।
    3. कई बार दोहराने के लिए एकाधिक "सेल खुरचनी" बनाने के लिए । नसबंदी और हवा के लिए ७०% इथेनॉल के साथ खींच पिपेट स्प्रे-उंहें सेल संस्कृति हूड में सूखी ।
  3. एक खुर्दबीन के नीचे, एक माइक्रो "सेल खुरचनी" थाली से धीरे अलग कर देना pigmented hPSC-RPE समूहों के लिए उपयोग करें ।
    1. धीरे (परिमार्जन नहीं) सीधे pigmented कोशिकाओं पर नल, जो संस्कृति के माध्यम में नाव एक बार वे अच्छी तरह से नीचे से अलग कर देना होगा ।
    2. तुरंत एक 20 µ एल micropipette का उपयोग करने के लिए धीरे असंबद्ध hPSC-RPE कोशिकाओं सक्शन और उंहें RPE माध्यम से एक पूर्व लेपित 6 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण24।
    3. लीजिए ~ 5 x 103 कोशिकाओं (~ 10% प्रवाह के रूप में एक 20X माइक्रोस्कोप के तहत मनाया) प्रत्येक पूर्व में एक 12 की अच्छी तरह से लेपित कदम 2.3.1-2.3.2 कई बार, के रूप में की जरूरत है । मध्यम की अंतिम मात्रा को 2 मिलीलीटर में लाएं ।
      नोट: असंबद्ध hPSC-RPE कोशिकाओं को दूर से रोकने के लिए, पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान प्लेटों की आवाजाही से बचने के लिए कि असंबद्ध कोशिकाओं को मध्यम में तैर रहे हैं, लेकिन अभी भी स्थानीय रूप से केंद्रित रहते हैं.
  4. संस्कृति नव पृथक hPSC-RPE कोशिकाओं (पी0) पर 12-अच्छी तरह से एक और 6-8 सप्ताह के लिए RPE माध्यम में प्लेटों के लिए उंहें एक pigmented monolayer फार्म (चित्रा 1C) के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. बदलें मध्यम 3x/ जब माध्यम बदल रहा है, एक अच्छी तरह से पुराने माध्यम की लगभग 1/3 मात्रा छोड़, और ताजा, पूर्व गर्म RPE मध्यम के 2/3 मात्रा में जोड़ें । इस स्तर पर, एक 12 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह के लिए RPE मध्यम के 2 मिलीलीटर का उपयोग करें (इस प्रकार, हर बार माध्यम से विनिमय १.३ मिलीलीटर) ।
    नोट: पी0 hPSC-RPE कोशिकाओं के monolayer गुंबदों फार्म कर सकते हैं, सुझाव है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से तरल पदार्थ परिवहन कर रहे हैं, और तंग25जंक्शनों द्वारा लंगर डाले हैं । इसलिए, गुंबद गठन परिपक्व RPE स्थिति का एक संकेतक है ।

3. Immunoblotting द्वारा RPE फाटे मान् यता

  1. proteinase अवरोधक कॉकटेल के साथ पूरक स्तनधारी प्रोटीन निष्कर्षण बफर का उपयोग कर hPSC-RPE सेल lysate बनाओ । undissolved सेल मलबे को छोड़ने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल lysate मशीन । lysate की कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने ।
  2. प्रकृति ४० 10 मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर Laemmli एसडीएस नमूना बफर में कुल प्रोटीन की µ जी अलग. 10% Tris-glycine एसडीएस पर एक स्थिर वोल्टेज पर प्रोटीन के नमूनों को पृथक करें ९० v के 15 मिनट के लिए और फिर १५० वी तक डाई फ्रंट जेल के नीचे तक पहुँच जाता है.
  3. 1 एच के लिए १०० V पर 10% मेथनॉल के साथ पूरक पूर्व-कूल्ड Tris-glycine बफर में एक nitrocellulose झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरण ।
  4. ब्लॉक Tris में झिल्ली ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट (TBST) और 5% गैर वसा शुष्क दूध 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच के साथ खारा बफर ।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली गर्मी 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अवरुद्ध बफर में पतला । इस प्रकार के रूप में RPE विशिष्ट मार्कर प्रोटीन लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी पतला: RPE65, 1:1000; CRALBP, 1:1000; BEST1, 1:1000 । β-actin के विरुद्ध एंटीबॉडी को 1:10000 में एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में β-actin का पता लगाने के लिए पतला करें ।
  6. TBST के साथ झिल्ली धो 3 बार, प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के साथ ।
  7. fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1 के साथ झिल्ली की मशीन, 1 के लिए बफर अवरुद्ध में 10000: कमरे के तापमान पर ।
  8. TBST के साथ झिल्ली धो 4 बार, प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट के साथ ।
  9. एक अवरक्त इमेजिंग प्रणाली (चित्रा 3) का उपयोग कर प्रोटीन का पता लगाने ।

4. Immunostaining द्वारा BEST1 उपसेलुलर स्थानीयकरण की जांच

  1. एक बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ hPSC-RPE कोशिकाओं को धोने और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर में तय ।
  2. दो बार पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो लो, और ०.१% गैर ईओण surfactant और 2% गधा सीरम ४५ मिनट के लिए गैर विशेष बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक के साथ पंजाब के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं गर्मी ।
  3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए BEST1 एंटीबॉडी (1:200 कमजोर पड़ने) के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  4. 3 बार पंजाबियों की 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए fluorophore संयुग्मित माध्यमिक आईजीजी (1:1000) के साथ मशीन ।
  5. एंटीबॉडी को हटाने के लिए 3 बार पंजाब के 2 मिलीलीटर से धो लें ।
  6. फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) द्वारा सना हुआ कोशिकाओं का निरीक्षण ।

5. रिकॉर्डिंग Ca2 +-निर्भर सीएल- वर्तमान hPSC-RPE में पूरे सेल पैच क्लैंप द्वारा

  1. 24-पैच दबाना से पहले 72 एच, एक पूरी तरह से धाराप्रवाह (एक 12 अच्छी प्लेट पर) परिपक्व पी0 hPSC-RPE कोशिकाओं के (cobblestone के आकार का और pigmented) विभाजित । मध् यम को महाप्राण, पंजाबियों के साथ एक बार धोएं और ०.०५% trypsin plus 1 U/µ l collagenase को अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर में डालें ।
    नोट: उपयोग करने से पहले ३७ ° c सही करने के लिए trypsin/collagenase पूर्व-गर्म ।
  2. 8 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    नोट: इस चरण के बाद, hPSC-RPE कक्ष अभी भी अनुयाई और कनेक्टेड हैं ।
  3. प्लेट से धीरे से कोशिकाओं को धोने के लिए एक 1 मिलीलीटर micropipette का प्रयोग करें, और पाचन मिश्रण में एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में गठबंधन करने के लिए पूर्व गर्म trypsin/collagenase के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें ।
    नोट: hPSC-RPE कोशिकाओं को इस बिंदु पर बड़े झुरमुट में अभी भी कर रहे हैं । जोरदार pipetting द्वारा कोशिका के झुरमुट को तोड़ने की कोशिश न करें । कुछ झुरमुट 1 मिलीलीटर टिप के भीतरी दीवार से चिपके हो सकते हैं ।
  4. 8 मिनट के लिए एक ३७ ° c शुष्क स्नान में शंकु ट्यूब की मशीन ।
  5. एक 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग करने के लिए धीरे पिपेट ऊपर और नीचे 10-15 बार पाचन मिश्रण ।
    नोट: सेल के झुरमुट बहुत छोटे हो जाते है लेकिन फिर भी दिखाई देते हैं । जोरदार pipetting से बचें ।
  6. पिछले दो चरणों को दोहराएं ।
    नोट: अधिकांश कक्ष pipetting के बाद एकल-कक्ष निलंबन में होने चाहिए. वहां अभी भी कुछ छोटे सेल के झुरमुट, जो स्वीकार्य हो सकता है । वैकल्पिक: कोमल pipetting के बाद एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर शंकु ट्यूब की मशीन । ३७ ° c पर trypsin/collagenase में कुल समय 30 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए (8 + 8 + 8 + 5 = 29) ।
  7. पचता कोशिकाओं से युक्त 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए पूर्व गर्म RPE मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए २०० x g पर स्पिन कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए । पुनः निलंबित और बीज कोशिकाओं पर पूर्व लेपित ३५ mm व्यंजन पर 10-20% प्रवाह (उदाहरणके लिए, एक १००% 10% प्रवाह के लिए ५ ३५ mm व्यंजन के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली पर अच्छी तरह से धाराप्रवाह) ।
    ध्यान दें: हर समय, जोरदार pipetting से बचें, जो महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है क्योंकि supernatant में केंद्रापसारक के बाद स्पष्ट अंधेरे सेल मलबे का प्रतिनिधित्व करते हैं । अच्छी तरह से अलग एकल सेल सीडिंग पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है ।
  8. पहले वर्णित के रूप में पूरे सेल पैच दबाना प्रदर्शन18,26,27,28,29,30,31। कदम संभावितों के एक परिवार से वर्तमान निशान प्राप्त (-१०० 0 एमवी की एक पकड़ क्षमता से + १०० एमवी) (चित्रा 5) ।
    नोट: आंतरिक और बाह्य समाधान के व्यंजनों क्रमशः तालिका 3 और तालिका 4में वर्णित हैं ।

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Representative Results

सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम मैनुअल अलगाव, जो एक विभेदित पी0 hPSC-RPE जनसंख्या की एक उच्च शुद्धता प्राप्त करना है । एक सफल अलगाव के बाद, > P0 जनसंख्या में 90% कोशिकाओं बढ़ेगा और हस्ताक्षर RPE morphologies (चित्रा 1C) प्रदर्शित करने के लिए परिपक्व होगा । गैर RPE या पी0 जनसंख्या में अपरिपक्व RPE कोशिकाओं के एक छोटे हिस्से के अस्तित्व लगभग अपरिहार्य है, लेकिन अनुप्रवाह प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा जब तक pigmented और cobblestone के आकार का hPSC-RPE कोशिकाओं की संख्या भारी है बहुमत.

hPSC-RPE आधारित रोग-एक डिश दृष्टिकोण के साथ, प्रत्येक रोगी विशिष्ट BEST1 उत्परिवर्तन व्यापक रूप से अपनी प्रोटीन अभिव्यक्ति (immunoblotting, चित्रा 3) के लिए vivo में विशेषता हो सकती है, झिल्ली की तस्करी ( immunostaining, चित्रा 4), और आयन चैनल समारोह (पूरे सेल पैच दबाना, चित्रा 5). ये परिणाम चैनल उत्परिवर्तनों के रोग तंत्र elucidating के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा, और व्यक्तिगत चिकित्सा के विकास के लिए ।

के रूप में BEST1 मुख्य रूप से RPE कोशिकाओं में व्यक्त की है, यह एक परिपक्व RPE स्थिति के सत्यापन के लिए एक सेलुलर मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ BEST1 उत्परिवर्तनों अपने प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित हो सकता है, तो अन्य अच्छी तरह से स्थापित RPE मार्करों जैसे RPE65 और CRALBP अभी भी मूल्यांकन किया जा करने की आवश्यकता (चित्रा 3).

परिपक्व पी0 hPSC-RPE कोशिकाओं के लिए 2-3 महीने के बंटवारे से पहले बनाए रखा जा सकता है (1पी के लिए) पूरे सेल पैच दबाना के लिए । पी0 3 महीने से अधिक पुराने कोशिकाओं पैच क्लैंप के लिए अनुशंसित नहीं हैं, लेकिन अभी भी immunoblotting और immunostaining प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: अलग चरणों में विभेदित hPSC-RPE कोशिकाओं । वर्णीय hPSC के प्रतिनिधि छवियों-संस्कृति प्लेटों में RPE समूहों में पहली उपस्थिति (एक), अलगाव से पहले (ख), और विकास के बाद परिपक्वता के बाद (ग) । आंख देखने और 20X चरण कंट्रास्ट छवियों क्रमशः ऊपर और नीचे पैनलों, में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रो सेल खुरचनी के प्रतिनिधि छवि एक पाश्चर पिपेट से खींच लिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: immunoblotting द्वारा विभेदित hPSC-RPE कोशिकाओं के परिपक्व RPE स्थिति के सत्यापन । RPE-विशिष्ट प्रोटीन मार्कर की अभिव्यक्ति दिखा दाग BEST1, RPE65, और CRALBP WT hPSC और hPSC-RPE कोशिकाओं में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: WT hPSC-RPEs में BEST1 का Immunostaining । (क) प्रतिनिधि immunofluorescent cobblestone के आकार hPSC-RPE कोशिकाओं में WT BEST1 की झिल्ली स्थानीयकरण दिखा छवियां । (ख) Immunostaining नकारात्मक नियन्त्रण BEST1 प्राथमिक एंटीबॉडी लोप गर्ने ।

Figure 5
चित्रा 5: hPSC-RPEs के पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग । (a) पूरे सेल पैच दबाना के लिए एक एकल hPSC-RPE सेल । (ख) प्रतिनिधि वर्तमान एक BEST1 WT hPSC से दर्ज निशान-RPE और पीक Ca 2 पर एक BEST1 रूपांतरित hPSC-RPE+। वोल्टेज के लिए उपयोग करता है प्रोटोकॉल धाराओं में दिखाया गया है डालने के लिए । स्केल बार = 1 एनए, १५० ms. देखें तालिका 3 और तालिका 4 पैच दबाना तैयारी विवरण के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक राशि
नॉक आउट (KO) DMEM ५०० एमएल
KO सीरम प्रतिस्थापन 15% (७५ mL)
अनावश्यक अमीनो अम्ल 1% (5 मिलीलीटर)
Glutamine 1% (5 मिलीलीटर)
पेनिसिलिन-streptomycin 1% (5 मिलीलीटर)
Nicotinamide 10 एमएम
मानव activin-क * १०० एनजी/
* मानव activin-एक 15 दिनों के दौरान पूरक है-भेदभाव प्रोटोकॉल के 28 ।

तालिका 1: RPE विभेद मध्यम ।

अभिकर्मक राशि
मेम (α संशोधन) ५०० एमएल
भ्रूण गोजातीय सीरम 5% (25 मिलीलीटर)
N1 अनुपूरक 1% (5 मिलीलीटर)
Glutamine-पेनिसिलिन-streptomycin 1% (5 मिलीलीटर)
अनावश्यक अमीनो अम्ल 1% (5 मिलीलीटर)
Taurine १२५ मिलीग्राम
Hydrocortisone 10 µ g
Triiodo-thyronin ०.००६५ µ छ

तालिका 2: RPE संस्कृति मध्यम ।

अभिकर्मक एकाग्रता
CsCl १३० एमएम
MgCl२ 1 मिमी
EGTA 10 एमएम
मैग्नीशियम एटीपी 2 मिमी
HEPES (पीएच ७.४) 10 एमएम
CaCl2* बदलता
ग्लूकोज * * ~ 5 मिमी
* वांछित सीए2 + एकाग्रता प्राप्त करने के लिए CaCl2 जोड़ें
* * osmolarity को समायोजित करने के लिए ग्लूकोज का उपयोग करें 290 – 295 mOsm/

तालिका 3: पैच दबाना आंतरिक समाधान ।

अभिकर्मक एकाग्रता
Nacl १४० एमएम
KCl 5 मिमी
MgCl२ 1 मिमी
CaCl२ 2 मिमी
HEPES (पीएच ७.४) 10 एमएम
ग्लूकोज ~ 5 मिमी
* उपयोग ग्लूकोज osmolarity को समायोजित करने के लिए 300 – 305 mOsm/

तालिका 4: पैच दबाना बाहरी समाधान ।

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Discussion

रोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया में एक डिश दृष्टिकोण एक रोग के साथ hPSCs अंतर करने के लिए सही कोशिका वंश है, जो BEST1के लिए RPE है उत्परिवर्तन के कारण है । इस प्रकार, प्रत्येक भेदभाव प्रयोग के बाद, परिणामी hPSC-RPE कोशिकाओं को ध्यान से उनके परिपक्व स्थिति के लिए मान्य किया जाना चाहिए RPE-विशिष्ट morphologies और प्रोटीन मार्करों16,17,18. एक ही उत्परिवर्तन के साथ एक ही रोगी या एकाधिक hESC क्लोनों से क्लोनल विरूपण साक्ष्य, एकाधिक hiPSC क्लोनों को कम करने के लिए जब भी संभव इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

दोनों hiPSC और hESC लाइनों RPE को एक ही प्रोटोकॉल के साथ अंतर किया जा सकता है । hiPSCs के साथ या BEST1 जीन में उत्परिवर्तन के बिना BEST1 रोगियों या स्वस्थ दाताओं, क्रमशः की त्वचा fibroblasts से फिर से कार्यक्रम किया जा सकता है । BEST1 में एक उत्परिवर्तन असर hESCs पैतृक hESC लाइन है, जो जंगली प्रकार (WT) BEST1 है से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हो सकता है । hiPSC-RPE और hESC-RPE मार्गों के अपने फायदे और नुकसान हैं. पूर्व अधिक रोगी विशेष और नैदानिक प्रासंगिक है, विशेष रूप से व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए । हालांकि, यह ध्यान देने योग्य बात है कि वहां hiPSC-RPE दृष्टिकोण के लिए कई सीमाएं हैं: 1) यह BEST1 रोगी नमूनों की पूरी स्पेक्ट्रम का उपयोग करने के लिए रसद मुश्किल है, के रूप में रोगियों से दान हमेशा नहीं दी जा सकती, और कुछ उत्परिवर्तनों बहुत पहली जगह में दुर्लभ; 2) गैर विशिष्ट phenotypes अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि और दाताओं की शारीरिक स्थितियों से परिणाम हो सकता है; 3) hiPSC RPE विभेद दक्षता के लिए भिंन दाताओं के लिए भिंन होता है, कि कुछ मामलों तकनीकी रूप से hiPSC-RPEs प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । दूसरी ओर, hESC-RPE मार्ग, हालांकि अधिक कृत्रिम, गैर पक्षपातपूर्ण कार्यात्मक जांच के लिए मांग पर वांछित उत्परिवर्तन के साथ isogenic hESC-RPEs उत्पंन करने के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करता है ।

परिपक्व RPE कोशिकाओं एक monolayer में तंग जंक्शनों द्वारा pigmented, बहुभुज, और जुड़े रहे हैं । पैच दबाना के लिए एक एकल सेल जनसंख्या में बंटवारे के बाद, हौसले से बीज hPSC-RPE कोशिकाओं बहुभुज आकार खो देंगे, लेकिन अभी भी कई दिनों के लिए रंजकता बनाए रखने (चित्र 5) । पैच दबाना 24-72 ज के बाद सेल विभाजन, जो समय के दौरान रंजकता अभी भी एक दृश्य मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अच्छा RPE स्थिति के साथ कोशिकाओं का चयन किया जाता है । एक सज्जन कोशिका अच्छी तरह से अलग एक कोशिकाओं के बहुमत में जिसके परिणामस्वरूप विभाजन महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु के बिना पैच दबाना की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है ।

कई अंय भिंनता अलग सेल संस्कृति मीडिया और विकास कारकों का उपयोग कर प्रोटोकॉल साहित्य में प्रलेखित किया गया है21,३२। hPSC को RPE के विभेद के लिए आवश्यक समय हमारे सहित इन सभी प्रोटोकॉलों में समान है, जबकि यह बताना कठिन है कि बिना किसी पक्ष-पक्ष की तुलना के विभेद कुशलता में कोई महत्वपूर्ण अंतर है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्तमान प्रोटोकॉल में, hPSC-RPE कोशिकाओं नियमित रूप से फ्लैट नीचे प्लेटों में लेकिन झिल्ली आवेषण के साथ प्लेटों पर नहीं हो रहे हैं, तो hPSC-RPE इस प्रक्रिया द्वारा उत्पंन vivo मेंदोहराऊंगा कोशिकाओं के ध्रुवीकरण सबसे अच्छा RPE नहीं हो सकता है । इसलिए, तकनीक के ऊपर वर्णित ज्यादातर एक अनुसंधान३३सेटिंग में अनुकूल हैं, हालांकि उत्पंन hPSC-RPE कोशिकाओं को भी Transwell प्लेटों में संस्कृतिित किया जा सकता है नैदानिक प्रयोजनों के लिए17monolayer RPE शीट फार्म ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना NIH अनुदान EY025290, GM127652 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और रोचेस्टर शुरू की वित्त पोषण विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knock-Out (KO) DMEM ThermoFisher 10829018
KO serum replacement ThermoFisher 10829028
Nonessential amino acids ThermoFisher 11140050
Glutamine ThermoFisher 35050061
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 10378016
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Human activin-A PeproTech 120-14
MEM (a modification) Sigma-Aldrich M4526
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
N1 supplement Sigma-Aldrich N6530
Glutamine-penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich G1146
Nonessential amino acids Sigma-Aldrich M7156
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0386
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T5516
mTeSR-1 medium Stemcell Technologies 5850
Matrigel Corning 356230
Collagenase Gibco 17104019
Trypsin VWR 45000-664
M-PER mammalian protein extraction reagent Pierce 78501
proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
RPE65 antibody Novus Biologicals NB100-355
CRALBP antibody Abcam ab15051
BEST1 antibody Novus Biologicals NB300-164
Beta Actin antibody ThermoFisher MA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG ThermoFisher A-21202
Goat anti-mouse IgG ThermoFisher SA5-35521
Goat anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-68071
Hoechst 33342 ThermoFisher 62249
HEKA EPC10 patch clamp amplifier Warner Instruments 895000
Patchmaster Warner Instruments 895040

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References

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आनुवंशिकी अंक १३८ मानव pluripotent स्टेम सेल hPSC रेटिना वर्णक उपकला hPSC-RPE रेटिना अपक्षयी रोगों रोग में एक डिश immunoblotting इम्यूनोफ्लोरेसेंस पैच दबाना BESTROPHIN1 BEST1 Ca2 +-सक्रिय सीएल- नाडी
भेदभाव, रखरखाव, और मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण: एक रोग <em>BEST1</em> उत्परिवर्तनों के लिए एक डिश मॉडल में
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