Мы представляем технику для бесконтактных микроманипуляции везикулы, используя локализованные кальций иона градиентов. Микроинъекции раствора ионов кальция, вблизи гигантских липидов везикул, используется для того чтобы remodel липидов мембраны, что приводит в производстве мембранных трубчатых выступов.
В широкий спектр основных клеточных процессов, как оборот мембраны и апоптоз клеточной мембраны форму переходы происходят одновременно с местные различия в концентрации ионов кальция. Были выявлены основные молекулярные компоненты, участвующие в этих процессах; Однако, конкретные взаимосвязи между градиентов ионов кальция и липиды внутри клеточной мембраны гораздо менее известно, главным образом из-за сложного характера биологических клеток и трудно систем наблюдения. Для преодоления этого разрыва, синтетический подход успешно реализуется раскрыть локализованные влияние ионов кальция на имитирует клеточной мембраны. Создание мнемосхемы напоминают условия в ячейке является severalfold проблемой. Во-первых для захвата физические свойства клеток требуется адекватного biomimetic модель с соответствующие размеры и состав мембраны. Во-вторых микроманипуляции установки требуется доставить небольшое количество ионов кальция в частности мембраны место. Наконец для обнаружения и записи отклика липидные мембраны к внешней стимуляции требуется схема наблюдения. Эта статья предлагает подробный biomimetic подход для изучения взаимодействия Ион мембраны кальция, где липидов везикул система, состоящая из гигантских однослойных везикул (GUV), подключенных к multilamellar везикул (МЛВ), подвергается локализованных кальция градиент формируется с помощью системы микроинъекции. Динамика ионного воздействия на мембрану были наблюдается с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны на видео кадров. В результате стимуляции мембраны высоко изогнутые мембраны трубчатых выступы (ССП) формируется внутри GUV, ориентированные от мембраны. Описанный подход вызывает Ремоделирование липидные мембраны и ССП производства полностью бесконтактных и контролируемым образом. Этот подход представляет средства для решения детали кальция Ион мембраны взаимодействий, предоставляя новые возможности для изучения механизмов перестройки клеточной мембраны.
Роль ионов кальция в биологических процессов, специально их причастности к сигнализации, клеточного деления и синтеза мембранных, находится в центре внимания многих механистический исследований1. Концентрация ионов внутриклеточных цитоплазматического кальция составляет порядка 100 Нм, в то время как кальция в органеллы, например эндоплазматического ретикулума, секреторные пузырьки и митохондрии, достигнуть уровня до десятки millimolars в концентрации. Это создает крутой кальция ионный градиент концентрации порядков через внутриклеточные мембраны2,3,4,5,6,7,8 ,9. Внеклеточным кальцием Ион уровень составляет около 2 мм, и следовательно, вариации концентрации ионов кальция происходят на внеклеточные и внутриклеточных уровнях. Кроме того последние исследования подтверждают что внутриклеточный кальций иона сигнализации событий и активности нейронов может произойти в условиях местные колебания концентрации ионов внеклеточным кальцием, указывая значение синхронизации внутри – и внеклеточной кальций иона вариации10.
Стремясь понять взаимосвязь между ионами кальция и биологических мембран, синтетический подход, в котором родной клеточных мембран заменяются липидного бислоя везикулы была успешно выполнена. Разоблачение везикулы решения ион кальция приводит к изменениям в голову групп липидов и углеводородной цепи упаковки, мембрана повышенной напряженности и везикул агрегации, а также сегрегации липидов и мембранный этап перехода11,12 ,13,14,,1516. Исследованы свойства липидные мембраны под воздействием ионов кальция, с использованием таких экспериментальных методов как рентген, 1H ЯМР и спектроскопические или термодинамические исследования11,16, 17 , 18. в этих исследованиях, состав мембраны настраивается часто напоминают родной клеточных мембран и содержит такие физиологические липиды как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилсерина (PS). PS особенно важна в подготовке искусственных везикул потому, что он является важным компонентом во многих клеточных процессах, включая торговлю внутриклеточные мембраны, экзоцитоз и апоптоз19,20.
Размер синтезируемых липидов везикулы часто колеблется от нанометров до нескольких микрометров. Среди различных везикул препаратов, гигантские однослойных везикул (GUVs), которые являются несколько десятков микрометров в диаметре, имеют особое значение из-за их сравнительно большого размера, напоминающий размеры отдельных клеток21 , 22 , 23. имеющаяся площадь поверхности GUVs позволяет влияние местных химические градиенты на мембраны биофизических свойств, чтобы быть изучены. Подвергая только частью поверхности мембраны на внешние раздражители, мембраны динамика могут расследоваться более тесно. Например было показано, что локализованные применение химического или рН градиентов к поверхности GUVs приводит к образованию трубчатых выступы, которые не наблюдались в основную экспозицию24,25. Наблюдаемые различия в поведении мембраны требуют дальнейшего развития метод допроса одного везикул схем получить некоторые идеи в механизмы клеточной мембраны ремоделирования.
Опираясь на методы микроинъекции и микроманипуляции от ранних 1900-х26,,27, в связи с более последними достижениями сингл везикул манипуляции схем х23,28 , эта статья представляет собой подход, в котором мембраны ремоделирования и формирование мембранных трубчатых выступы (ССП) в мембране GUV создаются в ответ на местном применении ионов кальция.
Наш подход использует везикул комплекс, состоящий из GUV подключен к multilamellar везикул (МЛВ) как biomimetic мембраны модель системы (рис. 1A). MLV требуется как резервуар липидного комплекса на поставку материала липидов в GUV во время воздействия на градиент ион кальция. Эта связь позволяет комплекс компенсировать рост напряженности мембраны при индуцированных ремоделирования форма перехода GUV мембраны и липиды для MTP роста. Кроме того, МЛВ облегчает поверхности иммобилизации, потому что его масса увеличивается по сравнению с GUV. GUV-MLV комплексы, когда иммобилизованных на твердом субстрате, ранее использовались для производства нанотрубок везикул сетей, изучение взаимодействия полимерные мембраны и подражая поздних стадиях экзоцитоз29,30, , 3132,33.
Предыдущие протоколы использовались сои экстракт полярных липидов (SPE) подготовить GUV-MLV комплексы28. SPE состоит из смеси фосфолипидов, которые включают PC (45,7%), PE (22,1%), фосфатидилинозитол (PI, 18,4%), фосфатидной кислоты (ПА, 6,9%) и смесь других липидов (6,9%). В настоящем документе нашей протоколе, смеси SPE легированного 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (натриевая соль) (DOPS) имитировать внутреннюю листовка плазматической мембраны клеток. Дополнительно 1% Атто 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-ДОПИНГ) используется для пятно липидного бислоя чтобы включить мониторинг реконструкции мембраны, с помощью микроскопии флуоресцирования. GUVs имеют симметричные липидного состава через бислоя и локально подвергаются 5 мм концентрации хлористого кальция (2CaCl). Такие экспериментальные условия, с концентрацией ионов кальция повышенной также имитировать внешней мембраны листовка apoptotic клеток, где молекулы PS, выраженной34. Формирование комплексов GUV-MLV требует использования метода модифицированных регидратации обезвоживания, первоначально разработанный КРИАДО и Келлер35. Везикул подготовка протокола включает в себя формирование сухой липидного слоя, который затем используется для формирования мелких пузырьков в растворе. Это решение затем обезвоживается и Регидратированные сформировать окончательный GUV-MLV комплексов. Рисунок 2A -D иллюстрирует основные шаги для подготовки типичного комплекса GUV-MLV.
После завершения подготовки везикул и комплекс везикул иммобилизованных на стеклянной подложке, микроинъекции техника используется для доставки небольшое количество ионов кальция к внешней листовка GUV через микропипеткой открытым кончик стекла. Поток раствора кальция из кончика создает локализованные кальция ионный градиент на поверхности мембраны GUV, приводит к реконструкции мембраны и поколения MTPs. MTPs ориентированы вдали от источника ионов кальция и расти внутри GUV. Это образование МТЗ могут контролироваться непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны с помощью цифровой камеры. Рисунок 3 показывает экспериментальной установки для производства ремоделирования мембраны. Формирование ССП (Рисунок 2E и рис. 4) в этом протоколе демонстрирует контрастных результат ион кальция экспозиции эксперименты, проведенные в условиях массовых объем. В условиях массовых GUVs разрыву и образуют мембраны патчи, которые могут наблюдаться присоединиться к поверхности стекла25.
Более подробную информацию о формировании GUV-MLV комплексов, а также процедуры для выполнения микроинъекции ионов кальция, описаны в этой статье. Протоколы являются в основном на микроинъекции ион кальция; Однако этот подход можно легко изменить для использования в изучении мембраны ответов за счет местного воздействия на другие ионы или белки. Кроме того в состав пузырьки могут быть настроены изолировать компонент роли липидов в процессе реконструкции мембраны. Представленные протокол не требует каких-либо сложного оборудования для производства GUV-MLV комплексов и характеризуется высокой степенью воспроизводимости.
Биомиметических систем клетки позволяют для исследования поведения мембраны под воздействием внешних стимулов например, ионы, белки или наночастиц. GUVs, будучи такой модели, может отвечать на изменения в химической среде, регулируя их форму, которая часто включает в себя формирование трубчатых структур и кариолеммы24,,4142,43 .
Эта статья предлагает подход к генерации MTPs через ремоделирования GUV поверхности на локализованных инъекции ионов кальция на поверхности GUV бесконтактных образом. Протокол описывает подготовку GUV-MLV комплекса, который имитирует мембрану клетки плазмы, а также как использовать микроинъекции технику для создания кальция градиентов ионов рядом GUV поверхности в форме ССП. Большинство предыдущих экспериментальных исследований, которые рассмотрены взаимодействия мембраны иона кальция воздействию липидов пузырьки для массового кальций иона концентрации14,17. В зависимости от экспериментальных условий такого массового воздействия может привести к различные мембраны ответ с не трубчатых выступов сформирован25.
Образование комплексов GUV-MLV довольно прост и требует только стандартного лабораторного оборудования, таких как роторный испаритель, Ультразвуковая ванна и вакуумного эксикатора. Тем не менее есть несколько критических шагов для рассмотрения в ходе подготовки везикул. Важно обеспечить обезвоживания везикулы полного (во время шага 2.3 протокола) и сухой круговой липидов фильм, содержащий только небольшое количество кристаллов соли образуется на поверхности стекла Крышка выскальзования. В ходе эксперимента тщательной обработке везикул решения, используя свежие липидов Стоковый раствор в хлороформе, а также свежие HEPES буфера, имеет важное значение для успешной подготовки GUV-MLV комплексов. Кроме того безопасные вложения на поверхность стекла Крышка выскальзования GUV-MLV комплекса имеет решающее значение для микроманипуляции и микроинъекции. Для подтверждения надлежащего адгезии GUV-MLV комплекс, микропипеткой (без инъекций потока) может использоваться для аккуратно вставьте против GUV поверхности. Твердо придерживался везикул не будет скользить по поверхности после прямого физического контакта. Поскольку эксперименты в капли открытого буфера, который может быть допрошен на несколько часов, испарение должны приниматься во внимание. Испарение из буфера капелька изменит осмотического условий, которые могут повлиять на и дестабилизировать везикулы. Чтобы восстановить осмотического условий, периодическое дополнение чистой воды для восстановления первоначального объема образца возвращает системы гомеостаза.
При изменении состава мембранных липидов, важно, что везикулы производятся в виде комплекса GUV-MLV потому что MLV позволяет для передачи материала липидов GUV во время перестройки мембраны. Предыдущие исследования показали, что замена компонентов смеси SPE с чистой липиды, или добавление 5-30% холестерина, также позволяет для GUV-MLV комплекс формирования28,44. Большинство подготовленных GUVs являются однослойных45.
Кроме того при тестировании других двухвалентной катионов, таких как ионы магния, формирование MTPs сильно зависит наличие отрицательно заряженных DOPS в смеси липидов. Без DOPS ССП не образуют в везикулы, указанных в настоящем Протоколе. Кроме того моновалентная катионов, таких как калий и натрий, не приводят к формированию ССП, даже в везикулы, содержащие DOPS25.
Помимо критические шаги в отношении подготовки и манипуляции GUVs есть несколько важных факторов, чтобы рассмотреть во время процедуры микроинъекции. Успешный микроинъекции ионов кальция сильно зависит от надлежащего функционирования стекла micropipettes, которые готовятся в день эксперимента. Существует несколько факторов, которые могут вызвать микропипеткой неисправности. Распространенной причиной является засорение кончик открытия. Малые липидов частицы, которые являются побочными продуктами подготовки везикул, рассредоточены в решении и склонны придерживаться кончик микропипеткой, создавая тем самым засорения. Очистка наконечник пипетки лучше всего сделать, подняв его из раствора везикул и поместив его обратно близко к поверхности GUV. Использование функции Воздуходувный микроинъекции насоса необходимо избегать потому, что это приводит к массовым инъекций в основной раствор ионов кальция. Кроме того небольшие воздушные пузыри в ловушке внутри микропипеткой предотвратить надлежащего микроинъекции, в котором случае микропипеткой следует заменить на новый. Совет поломки могут быть значительно минимизированы, поместив экспериментальной установки на антивибрационная таблицы для сведения к минимуму колебаний Совет.
Кроме того необходимо принимать при выборе схемы наблюдения, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание во время получения лучшее время решена изображений. Микроскопии флуоресцирования лазерно индуцированным поля был использован в этот протокол, потому что она позволяет для приобретения скорости относительно высокий имидж на глубине цель ограниченного зонд. Кроме того использование Перевернутый микроскопии позволяет одновременное микроинъекции и наблюдение везикулы липидов и ССП.
Одним из основных ограничений представленных метода является требование обширные ручной работы и достаточными навыками микроманипуляции. Потому что комплексы формируются в процессе спонтанного отек, невозможно контролировать размер GUVs и MLVs. Кроме того этот протокол не позволяет для контроля мембраны напряженности подготовленных GUV-MLV комплексов, которые может быть необходимо собрать дополнительную информацию в отношении реконструкции мембраны. GUVs подключены к MLVs с последней поставляя липидов материалом для существенного роста MTPs до такой степени, что было бы невозможно добиться исключительно использованием мембраны из GUVs. MLVs также способствовать снижению разброса боковой поверхностное натяжение в пределах GUV-MLV комплекс44, который бы осложнить попытки контролировать натяжение пузырьков с помощью микропипеткой аспирации. Эта модель на основе GUV-MLV предоставляют меньше напряжение, которое лучше имитирует режимов напряженности, в структуры клеточной мембраны, подключен к мембранных резервуаров, такие мембраны складок и кариолеммы46. В то же время метод аспирации микропипеткой может быть успешно применен контролировать натяжение мембраны в одном GUVs. Например работу Грабера et al. представил подробную информацию о формирования трубчатых кариолеммы мембраны в одной GUVs после связывания ионов кальция к мембране в условиях массовых от разнообразных напряженности режимов40. Наконец Сравнение поведения мембраны на как местных, так и массового воздействия кальция требует улучшения управления мембраны прилипания к поверхности, которая выходит за рамки настоящего Протокола.
Подводя итоги, предлагаемая методика позволяет для бесконтактных мембраны ремоделирования и формирования ССП на локализованных стимуляции с ионами кальция. Будущих приложений этот метод центра на перевод от синтетических везикул систем родной биологических мембран, например шелесту клеток. Предложенный метод может быть объединена с другими одноклеточных допроса схем, таких как патч зажим или микроэлектродные amperometry, или в сочетании с локализованных Отопление стратегии31,47,48. Тестирование влияния других ионов или молекул прост и включает в себя просто заменив ионов кальция с молекулами интерес. Кроме того комплекс синтетических липидов везикулы может производиться через мембраны функционализация трансмембранные белки, которые могут расширить наше понимание биофизики клетки реорганизация и клеточной мембраны динамика, связанные с зондирования местных химические градиенты. Не в последнюю очередь, бесконтактных стимуляции липидные мембраны также могут быть переведены для систем полимерных мягкой материи, предлагая основу для платформы Роман бесконтактных манипуляции.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |