Vi præsenterer en teknik til kontaktløse micromanipulation af vesikler, ved hjælp af lokaliserede calcium ion forløb. Mikroinjektion af en calcium ion opklaring, i nærheden af en kæmpe lipid vesikel, er udnyttet til at remodel lipid membranen, hvilket resulterer i produktionen af membran rørformede fremspring.
I en lang række grundlæggende celle processer, såsom membran handel og apoptose, forekomme cellemembranen figur overgange sammen med lokale variationer i Calciumionkoncentrationen. De molekylære hovedkomponenter involveret i disse processer er konstateret; men den specifikke samspillet mellem calcium ion gradienter og lipider i cellemembranen er langt mindre kendt, hovedsagelig på grund af de biologiske celler komplekse karakter og den difficultly for observation ordninger. For at slå bro over denne kløft, er en syntetisk tilgang med held gennemført for at afsløre lokaliseret effekten af calciumioner på cellemembranen efterligner. Oprettelse af en efterligner til at ligne betingelserne inden for en celle er et severalfold problem. Først, en passende biomimetiske model med passende dimensioner og membran sammensætning er forpligtet til at fange de fysiske egenskaber af celler. For det andet en micromanipulation opsætning er nødvendig for at levere en lille mængde af calciumioner til en særlig membran placering. Endelig er en bemærkning ordningen forpligtet til at spore og registrere svar af lipid membranen til den eksterne stimulation. Denne artikel giver en detaljeret biomimetiske tilgang til at studere calcium ion-membran interaktion, hvor en lipid vesikel system, bestående af en kæmpe unilamellar vesikel (GUV) forbundet til en multilamellar vesikel (MLV), er udsat for en lokaliseret calcium gradient dannet ved hjælp af en mikroinjektion system. Dynamikken i den ioniske indflydelse på membranen blev observeret ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og indspillede-video frame rates. Som følge af membran stimulation, buet stærkt membran rørformede fremspring (MTPs) dannet inde GUV, orienterede væk fra membranen. Den beskrevne fremgangsmåde inducerer remodellering af lipid membranen og MTP produktion i et helt kontaktløse og kontrolleret måde. Denne tilgang introducerer et middel til at behandle oplysninger om calcium ion-membran interaktioner, giver nye muligheder for at studere mekanismerne af cellemembranen omformningen.
Rollen af calciumioner inden for biologiske processer, specielt deres inddragelse i signalering, celledeling, og membranen fusion, er i fokus i mange Mekanistiske undersøgelser1. Intracellulære cytoplasmatisk Calciumionkoncentrationen er størrelsesordenen 100 nM, mens calcium i organeller, såsom endoplasmatiske reticulum, sekretoriske vesikler og mitokondrier, nå niveauer op til ti millimolars i koncentration. Dette skaber stejle calcium ion koncentration gradient størrelsesordener over intracellulære membraner2,3,4,5,6,7,8 ,9. Det ekstracellulære calcium ion niveau er ca 2 mM og derfor forekomme variationer af Calciumionkoncentrationen på begge de ekstracellulære og intracellulære niveauer. Desuden, de seneste undersøgelser dokumenterer, at intracellulære calcium ion signalering begivenheder og neuronal aktivitet kan finde sted under de lokale udsving af ekstracellulære calcium ion koncentrationer, der angiver betydningen af synkroniseret intra- og ekstracellulært calcium ion varianter10.
Med henblik på at forstå samspillet mellem calciumioner og biologiske membraner, en syntetisk tilgang, hvor indfødte cellemembraner er erstattet med lipid tolagede vesikler er gennemført med succes. Udsætter vesikler til calcium ion løsninger fører til ændringer i lipid hoved grupper og kulbrinte kæde pakning, øget membranen spændinger, og vesikel sammenlægning og opdeling af lipider og membran fase overgang11,12 ,13,14,15,16. Egenskaber i lipid membraner ved udsættelse for calciumioner er blevet undersøgt ved hjælp af sådanne eksperimentelle teknikker som X-ray, 1H-NMR og spektroskopiske eller termodynamiske undersøgelser11,16, 17 , 18. i disse studier, membran sammensætning er ofte indstillet til at ligne indfødte cellemembraner og indeholder sådanne fysiologiske lipider som phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE) og Phosphatidylserin (PS). PS er især vigtig i kunstige vesikel forberedelse, fordi det er et væsentligt element i mange cellulære processer herunder intracellulære membran handel, exocytose og apoptose19,20.
Størrelsen på syntetiserede lipid vesikler ofte spænder fra nanometer til flere mikrometer. Blandt forskellige vesikel præparater, giant unilamellar vesikler (GUVs), som har flere til et tocifret af mikrometer i diameter, er af særlig betydning på grund af deres relativt store størrelse, der ligner dimensioner for enkelte celler21 , 22 , 23. det tilgængelige areal af GUVs giver effekten af lokale kemiske gradienter på membran biofysiske egenskaber til at blive undersøgt. Ved at udsætte kun en del af membranen overflade til de eksterne stimuli, kan membranen dynamics undersøges nærmere. For eksempel, har det vist sig at lokaliseret anvendelse af kemiske eller pH forløb på overfladen af GUVs fører til dannelsen af rørformede fremspring, som ikke blev overholdt på bulk eksponering24,25. De konstaterede forskelle i membranen adfærd kræver yderligere metodeudvikling af single-vesikel forhør ordninger at få nogle indblik i mekanismerne i cellemembranen remodellering.
Bygger på metoder til mikroinjektion og micromanipulation fra det tidlige 1900-tallet26,27, i forbindelse med nyere fremskridt for single-vesikel manipulation ordninger fra 2000s23,28 , denne artikel præsenterer en tilgang, i hvilken membran remodeling og dannelsen af membran rørformede fremspring (MTPs) i GUV membran er genereret svar til lokal anvendelse af calciumioner.
Vores tilgang udnytter en vesikel kompleks bestående af en GUV tilsluttet en multilamellar vesikel (MLV) som en biomimetiske membran modelsystem (figur 1A). MLV er påkrævet som en lipid reservoir for kompleks til at levere lipid materiale til GUV under eksponering til et calcium-ion gradient. Denne forbindelse gør det komplekse til at kompensere for stigningen i membranen spændinger under induceret remodellering og forme skiftes af GUV membran og lipider MTP vækst. Desuden, MLV letter den overflade immobilisering, fordi dens masse er større sammenlignet med GUV. GUV-MLV komplekser, når immobiliseret på et fast underlag, har tidligere været brugt til fremstilling af nanorør-vesikel netværk, studerer polymer-membran interaktion og efterligne de sene stadier af exocytose29,30, 31,32,33.
Tidligere protokoller udnyttet sojabønner polar lipid ekstrakt (SPE) til at forberede GUV-MLV komplekser28. SPE består af en blanding af fosfolipider, der inkluderer PC (45,7%), PE (22,1%), phosphatidylinositol (PI, 18,4%), phosphatidic syre (PA, 6,9%), og en blanding af andre lipider (6,9%). I vores protokol heri, SPE blandingen er dopet med 20% af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumsaltet) (DOPS) til at efterligne den indre folder af plasma cellemembranen. En yderligere 1% af ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) bruges til at plette lipid tolagede for at aktivere overvågning af membran remodeling ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. GUVs har symmetriske lipid sammensætning på tværs af tolagede og er udsat lokalt til 5 mM koncentrationer af calciumchlorid (CaCl2). Sådanne forsøgsbetingelser, med en forhøjet Calciumionkoncentrationen efterligner også ydre membran indlægsseddel apoptotiske celler, hvor PS molekyler er udtrykt34. Dannelsen af GUV-MLV komplekser kræver brug af en modificeret rehydrering-dehydrering metode oprindeligt udviklet af Criado og Keller35. Vesikel forberedelse protokol omfatter dannelsen af en tør lipid lag, som derefter bruges til at danne små blærer i løsning. Denne løsning er derefter dehydreret og rehydreret for at danne de endelige GUV-MLV komplekser. Figur 2A -D illustrerer de vigtigste skridt til forberedelse af et typisk GUV-MLV kompleks.
Efter vesikel forberedelse er afsluttet og den komplekse vesikel er immobiliseret på glas substrat, bruges mikroinjektion teknik til at levere små mængder af calciumioner af ydre indlægsseddel af GUV gennem en åben-tip glas mikropipette. Strømmen af calcium løsning ud af spidsen genererer en lokaliseret calcium ion gradient på GUV membranen overflade, hvilket fører til membran remodellering og generation af MTPs. MTPs er orienteret fra calcium ion kilde og vokse inde i GUV. Denne MTP dannelse kan være direkte overvåges ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og registreres ved hjælp af et digitalt kamera. Figur 3 viser opsætningen af eksperimenterende anvendes til fremstilling af membran remodellering. Dannelsen af MTPs (figur 2E og figur 4) i denne protokol viser en kontrasterende resultat at calcium ion eksponering eksperimenter udført i bulk volumen betingelser. Under bulk betingelser, i GUVs briste og danne membran patches, som kan observeres for at tiltræde glas overflade25.
Yderligere oplysninger om dannelsen af GUV-MLV komplekser, samt at udføre mikroinjektion af calciumioner procedure, er forklaret i denne artikel. Protokollerne er stort set fokuseret på calcium ion mikroinjektion; denne fremgangsmåde kan dog nemt ændres til brug i at studere membran svar på grund af lokal eksponering for andre ioner eller proteiner. Derudover kan sammensætningen af vesikler indstilles for at isolere lipid komponent roller i processen med membran remodeling. Den præsenterede protokol kræver ikke nogen sofistikeret udstyr til at producere GUV-MLV komplekser og er karakteriseret ved en høj grad af reproducerbarhed.
Biomimetiske celle systemer giver mulighed for undersøgelse af membran adfærd ved udsættelse for eksterne stimuli som ioner, proteiner eller nanopartikler. GUVs, at være sådan en model, kan reagere på ændringer i det kemiske miljø ved at justere deres form, som ofte involverer dannelsen af rørformede strukturer og invaginations24,41,42,43 .
Denne artikel indeholder en fremgangsmåde til at generere MTPs i en kontaktløs måde via remodellering af GUV overfladen ved lokaliserede injektion af calciumioner på GUV overflade. Protokollen beskriver forberedelse af GUV-MLV-komplekset, som efterligner en celle plasmamembran samt, hvordan til at ansætte en mikroinjektion teknik til at generere calcium ion forløb tæt på GUV overflade til at danne MTPs. Fleste af tidligere eksperimentelle undersøgelser, behandles calcium ion-membran interaktioner udsat lipid vesikler til bulk calcium ion koncentration14,17. Afhængigt af de eksperimentelle betingelser, kan sådan bulk eksponering resultere i forskellige membran svar med rørformede fremspring dannet25.
Dannelsen af GUV-MLV komplekser er temmelig ligetil og kræver kun almindeligt laboratorieudstyr, såsom en roterende fordamper, ultralyd bad og vakuum ekssikkator. Alligevel er der stadig flere vigtige skridt til at overveje at vesikel forberedelsen. Det er vigtigt at sikre, at dehydrering af vesikler er komplet (under trin 2.3 i protokollen) og en tør cirkulære lipid film der indeholder kun en lille mængde salt krystaller dannes på overfladen af glas dækning slip. Omhyggelig håndtering af vesikel løsning, ved hjælp af friske lipid stamopløsning i kloroform samt friske HEPES buffer, er afgørende for vellykket forberedelse af GUV-MLV komplekser under eksperimentet. Sikker fastgørelse af GUV-MLV kompleks glas dækning slip overflade er desuden afgørende for micromanipulation og mikroinjektion. For at bekræfte tilstrækkelig vedhæftning af GUV-MLV komplekse, mikropipette (uden injektion flow) kan bruges til at forsigtigt skubbe mod GUV overflade. En fast overholdt vesikel vil ikke glide langs overfladen ved direkte fysisk kontakt. Fordi eksperimenterne er udført i en åben buffer droplet, som kan blive afhørt i flere timer, skal fordampning tages i betragtning. Fordampning fra buffer slipværktøjet vil ændre de osmotiske betingelser, som kunne påvirke og destabilisere vesikler. Hvis du vil gendanne osmotisk betingelser, returnerer periodiske tilsætning af rent vand til at prøve at gendanne den oprindelige diskenhed systemet til homøostase.
Når du ændrer lipid membranen sammensætning, er det afgørende, at vesikler er produceret i form af et GUV-MLV kompleks fordi MLV giver mulighed for overførsel af lipid materiale til GUV under membran omdannelsen. Tidligere undersøgelser har vist, at erstatte komponenter af SPE blanding med ren lipider, eller tilføje 5-30% af kolesterol, også giver mulighed for GUV-MLV kompleks dannelse28,44. Fleste af de tilberedte GUVs er unilamellar45.
Desuden, når du tester andre divalent kationer, såsom magnesiumioner, dannelsen af MTPs stærkt afhænger af tilstedeværelsen af negativt ladede DOPS i lipid blanding. Uden DOPS udgør MTPs ikke i de blærer, der er beskrevet i denne protokol. Også, monovalent kationer, kalium og natrium, ikke resulterer i dannelsen af MTPs, selv i DOPS-holdige vesikler25.
Ud over de kritiske trin vedrørende forberedelse og manipulation af GUVs er der flere vigtige faktorer at overveje ved mikroinjektion procedure. Den succesfulde mikroinjektion af calciumioner stærkt afhængig af fungerende glas Mikropipetter, som tilberedes på dagen af forsøget. Der er flere faktorer, der kan forårsage mikropipette funktionsfejl. En almindelig årsag er en tilstoppet tip åbning. Lille lipid partikler, som er biprodukter af vesikel forberedelse, er spredt i løsningen og har tendens til at tiltræde mikropipette tip, derved skabe en tilstopning. Rengøring pipette tip gøres bedst ved at løfte det op fra vesikel løsningen og placere det tilbage tæt på GUV overflade. Brugen af blow-out funktion af mikroinjektion pumpen skal undgås, fordi det resulterer i massiv indsprøjtning af calciumioner i bulk løsning. Derudover forhindre små luftbobler fanget inde mikropipette korrekt mikroinjektion, som tilfældet mikropipette bør udskiftes med en ny. Tip brud kan minimeres væsentligt ved at placere den eksperimentelle setup på en vibrations-dæmpning tabel at minimere tip svingninger.
Derudover skal pleje tages, når du vælger en observation ordning, at minimere photobleaching, samtidig med at opnå de bedste tidsopløst billeder. Wide-felt laser-induceret Fluorescens mikroskopi blev udnyttet i denne protokol, fordi det giver mulighed for en relativt høj image erhvervelse sats på en objektiv begrænset sonde dybde. Desuden brug af inverteret mikroskopi giver mulighed for samtidige mikroinjektion og observation af lipid vesikler og MTPs.
En af de vigtigste begrænsninger af metoden præsenteres er kravet om omfattende manuelt arbejde og tilstrækkelig micromanipulation færdigheder. Fordi komplekser er dannet gennem en spontan proces, hævelse, ikke kan GUVs og MLVs størrelse kontrolleres. Denne protokol tillader desuden ikke til kontrol af membran spændingen i de forberedte GUV-MLV komplekser, som kan være nødvendigt at indsamle yderligere oplysninger om membran remodellering. GUVs er forbundet til MLVs med den sidstnævnte leverer lipid materiale for den betydelige vækst i MTPs i et omfang, der ville være umuligt at opnå, udelukkende udnytter den membran, der er tilgængelige fra GUVs. MLVs også bidrage til at sænke enhver laterale overfladespænding variationer inden for den GUV-MLV komplekse44, som ville vanskeliggøre forsøg på at styre spændingen i vesikel ved hjælp af mikropipette aspiration. Denne GUV-MLV-baseret model giver en lavere spænding, der bedre efterligner de spænding regimer fundet i cellulære membran strukturer forbundet med membran reservoirer, såsom membran folder og invaginations46. På samme tid, kan mikropipette aspiration teknik anvendes med succes for at styre membran spændinger i enkelt GUVs. For eksempel tilsendt arbejde af Graber et al. detaljer på dannelsen af membran rørformede invaginations i enkelt GUVs ved binding af calciumioner membran på bulk betingelser fra varieret spænding regimer40. Endelig, sammenligning af membran adfærd på både lokale og bulk eksponering for calcium kræver bedre kontrol af membranen vedhæftning til overfladen, som er uden for rammerne af denne protokol.
For at opsummere, den foreslåede teknik gør det muligt for kontaktløse membran remodellering og dannelsen af MTPs ved lokaliserede stimulation med calciumioner. Fremtidige anvendelser af denne metode center på oversættelse fra syntetisk vesikel systemer til native biologiske membraner, såsom celle blebs. Den foreslåede metode kan være indarbejdet med andre encellede forhør ordninger, som patch-klemme eller mikroelektrode amperometry, eller kombineret med lokaliseret varme strategier31,47,48. Test effekt af andre ioner eller molekyler er ligetil og indebærer simpelthen erstatter calciumioner med molekyler af interesse. Derudover kan komplekse syntetiske lipid blærer produceres gennem membran functionalization med transmembrane proteiner, som kan udvide vores forståelse af Biofysik af celle omlægning og cellemembranen dynamics tilknyttet sansning af lokale kemiske gradienter. Sidst men ikke mindst, kontaktløse stimulation af lipid membranen kan også oversættes til polymere bløde sagen systemer, tilbyder et grundlag for en roman kontaktløse manipulation platform.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |