Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima
Summary
Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) en la médula mamífera adultos son una población mitotically relativamente quieta de periventricular células que pueden ser estudiados en vitro usando el ensayo desarrolló. Este ensayo de formación de colonias es una poderosa herramienta para estudiar la respuesta de NSCs a factores exógenos en un plato; sin embargo, esto puede también usarse para estudiar el efecto de manipulaciones en vivo con la correcta comprensión de las fortalezas y limitaciones del ensayo. Una manipulación de interés clínico es el efecto de la lesión en la activación endógena del NSC. Modelos actuales de la lesión de la médula espinal proporcionan un reto estudiar esto ya que la severidad de modelos comunes de contusión, compresión y corte transversal de la destrucción del nicho de la NSC en el sitio de la lesión donde residen las células madre. Aquí, describimos un modelo de lesión mínima que produce daños localizados en la superficie dorsolateral superficial del nivel torácico inferior (T7/8) de la médula espinal de ratón adulto. Este modelo de lesión repuestos del canal central en el nivel de la lesión y permite el análisis de la NSC que residen en el nivel de la lesión en varios puntos del tiempo después de lesión. A continuación, os mostramos cómo puede utilizarse el ensayo desarrolló para estudiar la activación de las dos poblaciones distintas, relacionadas linealmente de NSCs que residen en la región periventricular de médula espinal – NSCs primitivos y definitivos (pNSCs y dNSCs, respectivamente). Demostramos cómo aislar y cultura estos NSC de la región periventricular a nivel de la lesión y el sitio de la lesión de materia blanca. Nuestras disecciones post quirúrgica de la médula espinal muestran mayor número de sus y neuroesferas dNSC deriva de la región periventricular de cuerdas heridas comparado con controles, hablando su activación a través de lesiones. Además, tras lesión, neuroesferas derivó dNSC pueden aislarse desde el sitio de lesión, demostrando la capacidad de NSC para migrar desde su nicho periventricular a sitios de lesión.
Introduction
El sistema nervioso central contiene una subpoblación de células multipotentes, renueva a sí misma que tiene la capacidad para dar lugar a todas las diferentes células neuronales maduros tipos1,2,3,4. Estas células madre neurales (NSC) residen en nichos especializados en el cerebro y la médula espinal y puede ser activadas después de lesión para proliferar, migrar y diferenciarse en células nerviosas maduras. NSC y su progenie ha demostrado a migrar hacia el sitio de lesión en lesión cortical modelos5,6. En el cerebro, ha demostrado NSC para migrar desde los ventrículos laterales en el sitio de la lesión donde se diferencian en astrocitos que contribuyen a la formación de cicatriz glial7. Sin embargo, en la médula espinal, se han realizado pocos estudios para preguntar si estos mismo NSCs endógenos pueden aprovecharse para promover la recuperación después de lesión de la médula espinal. De hecho, actualmente existe un debate respecto a si la activación de la piscina de la célula de vástago en la médula espinal requiere un daño físico directo del nicho periventricular Revestimiento canal central8 o si el daño al espinal médula parénquima (dejando el tallo nicho de células intacta) es suficiente para activar endógeno NSCs9.
Un número de modelos de lesión (SCI) de la médula espinal se ha utilizado para estudiar la fisiopatología de la lesión aguda y crónica. Estos modelos también se han utilizado para probar terapias potenciales para tratar SCI neuroprotección, inmunomodulación y desarrollo celular trasplante y reemplazo estrategias10,11,13. Los modelos actuales incluyen lesiones compresión o contusión, causantes de déficit funcional a gran escala, así como lesiones extensas y cavitaciones en el cable14,15. Las cicatrices gliales resultantes pueden abarcar varios segmentos espinales junto con la mayoría de la anchura, la circunferencia de la médula espinal16. Así, mientras que estos modelos son clínicamente relevantes, pueden permitirse desafíos significativos para estudiar la respuesta de NSCs endógenas después de lesión. Hay modelos químicos de lesiones que se pueden adaptar para hacer que las formas más leves de lesión que puede evitar el canal central17. Sin embargo, este tipo de lesiones se centran en la desmielinización asociada a SCI y no modelos clínicamente relevantes para el daño físico o mecánico asociado con LME traumáticas.
Para hacer frente a las limitaciones de los modelos actuales de la lesión, hemos adaptado un aguja pista SCI modelo mínimo, desarrollado originalmente en el rata9, para la aplicación de un modelo de ratón adulto. Nuestro modelo de lesión adaptado puede crear una lesión consistente de la región dorsolateral de la médula espinal de ratón y el canal central en el nivel de lesión (es) de repuesto. La ventaja de este modelo es que permite el estudio de la cinética de la NSC después de lesiones y su potencial migración radial en el sitio de la lesión. El uso de un modelo de ratón también permite el uso de ratones transgénicos que permiten seguimiento de linaje de NSCs endógenos y su progenie después de lesión. Las propiedades de NSCs adicional pueden ser evaluadas utilizando una forma modificada de la prueba en vitro desarrolló que se introduce en el presente Protocolo.
El ensayo desarrolló es un en vitro formando Colonia ensayo que permite el aislamiento de NSCs en presencia de mitógenos. En densidades de galjanoplastia clonal, NSCs individuales proliferan para dar lugar a colonias esféricas libres de células que se componen de una pequeña subpoblación de NSCs y una gran mayoría de progenitores18,19. En nuestro protocolo, demostramos el aislamiento de dos NSCs distintos, relacionados linealmente desde la región periventricular de la médula espinal, bajo las condiciones iniciales y siguiendo nuestro modelo mínimo de SCI. Definitivo neural nestin expresa células (dNSCs) y la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) y se cultivan en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y heparina (juntos llamada EFH)20. Estos dNSCs son raras en la médula espinal de ingenua, dando lugar a muy pocos neuroesferas en vitro. Sin embargo, nos demuestran que dNSCs se activan después de SCI mínimo, ampliar el número de neuroesferas aisladas de la región periventricular del21. Primitivo las células madre neurales (pNSCs) son de dNSCs en el linaje de células madre neurales. pNSCs son excesivamente raros, expresados bajos niveles de los marcadores de pluripotencia Oct4 y leucemia (LiF) factor inhibitorio de la respuesta22. pNSCs no forman neuroesferas cuando están aisladas de la médula espinal de ratón adulto debido a la presencia de la proteína básica de mielina (MBP) en cultivos primarios; sin embargo, neuroesferas pueden ser aislado de ratones deficientes de MBP y su número es mayor que sigue lesión, similar a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neuroesferas derivadas de dNSC pueden ser aislado desde el sitio de la lesión en el temprano épocas después de SCI mínimo. Estos resultados demuestran que nuestro modelo de la lesión y análisis pueden determinar las características de activación de periventricular NSC como su capacidad para proliferar y migrar en respuesta a la lesión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante el procedimiento quirúrgico, existen algunos pasos críticos donde el investigador debe prestar especial atención a fin de obtener resultados óptimos y minimizar la variabilidad entre los animales. Debe tener cuidado con la anestesia inhalada (isoflurano) durante la cirugía, la anestesia se ha demostrado para tener efectos neuroprotectores con exposición prolongada27. Por consiguiente, al estudiar la capacidad regenerativa de la médula espinal después de lesión, hacer un esfuerzo p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es financiado por la Fundación de Krembil (subvención de funcionamiento CMM). WX fue el ganador del Premio student Carlton Marguerite Smith. NL recibió una beca de postgrado de Ontario.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
Referências
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neurociência. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
