Summary

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Published: September 13, 2018
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Summary

Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.

Abstract

Células-tronco neurais (NSCs) na medula espinhal dos mamíferos adulta são uma população relativamente mitotically quiescente de periventriculares células que podem ser estudados em vitro usando o ensaio de neurosphere. Este ensaio formadoras é uma poderosa ferramenta para estudar a resposta de NSCs para fatores exógenos em um prato; no entanto, isto também pode ser usado para estudar o efeito de manipulações na vivo com a compreensão apropriada dos pontos fortes e limitações do ensaio. Uma manipulação do interesse clínico é o efeito da lesão na ativação endógena do NSC. Modelos atuais de lesão da medula espinhal fornecem um desafio para estudar isto como a gravidade dos modelos comuns de contusão, compressão e transecção causar a destruição do nicho NSC no local da lesão onde residem as células-tronco. Aqui, descrevemos um modelo de lesão mínima que causa danos localizados na superfície dorsolateral superficial do piso inferior torácica (T7/8) da medula espinhal rato adulto. Este modelo de lesão poupa o canal central ao nível da lesão e permite a análise de NSCs que residem no nível da lesão em vários pontos de tempo após lesão. Aqui, nós mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser utilizado para estudar a ativação de duas populações distintas, relacionadas com lineally, de NSCs que residem na região periventricular da medula espinhal – NSCs primitivos e definitivos (pNSCs e dNSCs, respectivamente). Demonstramos como isolar e cultura estes NSCs da região ao nível da lesão e o local da lesão de substância branca periventricular. Nossas dissecações pós-cirúrgica da medula espinhal mostram aumento do número de pNSC e neurospheres dNSC-derivado da região periventricular das cordas feridas comparados aos controles, falando de sua ativação através de lesão. Além disso, após lesão, neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão — demonstrando a capacidade de NSCs para migrar do seu nicho periventricular para locais de ferimento.

Introduction

O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial7. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central8 ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs9.

Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do16da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central17. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.

Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato9, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.

O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)20. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular21a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)22. pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade de Toronto e está em conformidade com o “guia para o cuidado e uso de animais experimentais” (2nd Edition, conselho canadense no cuidado Animal, 2017). 1. cirurgia de lesão medular mínima Nota: Antes da cirurgia certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são esterilizados por métodos apropriados (figura 1A). Const…

Representative Results

Após a cirurgia, os ratos devem experiência mínimos déficits motor, que podem incluir a cauda e possível paresia do membro posterior para até 24 h. Após este tempo, os ratos não devem experimentar nenhuma paralisia do membro posterior e/ou paresia e alterações mínimas na marcha. A Figura 3 mostra resultados representativos de ensaio de neurosphere 5 dias após a lesão mínima da medula e…

Discussion

Durante o procedimento cirúrgico, existem alguns passos críticos onde o pesquisador deve prestar particular atenção a fim de obter resultados óptimos e minimizar a variabilidade entre os animais. Deve ter cuidado com a anestesia inalada (isoflurano) durante a cirurgia como anestésico foi mostrado para ter efeitos neuroprotective com exposição prolongada27. Nesse sentido, ao estudar a capacidade regenerativa da medula espinhal após lesão, fazer um esforço para realizar a cirurgia, mais r…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é financiado pela Fundação Krembil (subvenção de funcionamento CMM). WX foi o destinatário do prêmio estudante Carlton Marguerite Smith. NL recebeu uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

Materials

Agricola Retractor Fine Science Tools 17005-04
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) Fine Science Tools 15370-50 Customize when ordering to get blunted tips
Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) Fine Science Tools 11152-10 Or any other forceps for suturing
Hartman Hemostats (Straight) Fine Science Tools 13002-10 Or any other appropriate for suturing
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Or any other appropriate
Hair clippers amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA or any other appropriate
Stereotaxic instrument Stoeling 51500 or any other appropriate
Buprenorphine or any appropirate sanctioned my animal care facility
Meloxicam or any appropriate sanctioned by animal care facility
Tears Naturale P.M. Alcon https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE or any other appropriate
Isoflurane Baxter International Inc DIN 02225875 or any other appropriate for anesthesia
Q-tips Cottom Swabs amazon.ca https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze Fisher Scientific 13-761-52
30G Needles Becton Dickinson 305106 For Injury
25G Needles Becton Dickinson 305122 For Drug injections
1mL Syringes Becton Dickinson 3090659 for drug injections
3mL Syringes Becton Dickinson 309657 for fluid injections
4-0 Suture uoftmedstore.com 2297-VS881 for skin suturing
6-0 Suture uoftmedstore.com VS889 for muscle suturing
Polysporin ointment amazon.ca 102051
Isoflurane Vaporizer VetEquip 901806
15mL conical tubes ThermoFisher Any appropriate
Petri Dishes ThermoFisher any appropriate
Trypan Blue ThermoFisher Any
Hemocytometer ThermoFisher Any appropriate
Centrifuge ThermoFisher Any appropriate
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000
Counting Microscope Olympus CKX41
Neural Basal-A Medium Invitrogen 10888-022
B27 Invitrogen 17404-044
Penicillin- Streptomycin Gibco 15070
L- Glutamine Gibco 25030
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 12700075
30% Glucose Sigma G6152 1M- 9.01g in 100mL dH2O
1M Glucose
7.5% NaHCO3 Sigma S5761 155mM- 1.30g in 100mL dH2O
155mM NaHCO3
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g in 100mL dH2O
Apo-Transferrin R&D Systems 3188-AT
Putrescine  Sigma P7505
Insulin Sigma I5500
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Papain Dissociation System  Worthington Biochemical Corporation PDS 1 vial of papain can be used for 2 samples
Epidermal Growth Factor Invitrogen PMG8041 Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Fibroblast Growth Factor Invitrogen PHG0226 Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Heparin Sigma H3149
Leukemia Inhibitory Factor In House
Trypan Blue
Hemocytometer
24 well Plates NUNC
2M NaCl Sigma S5886 11.69g in 100mL dH2O
1M KCL Sigma P5405 7.46g in 100mL dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33g in 100mL dH2O
108mM CaCl2 Sigma  C7902 1.59g in 100mL dH2O

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Citar este artigo
Lakshman, N., Xu, W., Morshead, C. M. A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (139), e57727, doi:10.3791/57727 (2018).

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