Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.
Cellulaire processen worden gereguleerd door interacties tussen biologische moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en metabolieten. Terwijl het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie (PPI) geen noviteit is, vormen experimentele benaderingen willen karakteriseren van endogene eiwit-metaboliet interacties (PMI) een vrij recente ontwikkeling. Hierin presenteren wij een protocol waarmee gelijktijdige karakterisering van de PPI en PMI van een proteïne van keuze, hierna aangeduid als aas. Ons protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis cel-culturen en affiniteit zuivering (AP) combineert met de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van eiwit en metaboliet detectie. Kortom, zijn transgene Arabidopsis lijnen, uitdrukken van aas eiwit gesmolten tot een affiniteit tag, eerst lysed om een inheemse cellulaire extract bekomen. Anti-label antilichamen worden gebruikt voor pull-down eiwit en metaboliet partners van het aas-eiwit. De complexen affiniteit-gezuiverd worden geëxtraheerd met behulp van een one-step methyl- tert-butyl ether (MTBE) / methanol/water-methode. Terwijl metabolieten in de polar of de hydrofobe fase verdeelt, kunnen eiwitten worden gevonden in de pellet. Zowel de metabolieten en de eiwitten worden vervolgens geanalyseerd door ultra krachtige vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS of UPLC-MS/MS). Leeg-vector (EV) controle lijnen worden gebruikt om uit te sluiten van valse positieven. Het grote voordeel van onze protocol is dat het identificatie van eiwitten en metaboliet partners van een doel-eiwit in parallel in in de buurt van de fysiologische omstandigheden (mobiele lysate) mogelijk maakt. De onderhavige methode is eenvoudig, snel en kan gemakkelijk aangepast worden aan biologische systemen dan plant celculturen.
Hier beschreven de methode beoogt de identificatie van metaboliet en eiwit partners van een proteïne van keuze in de omgeving vanin-vivo cellulaire lysate voorwaarden. Er werd gespeculeerd dat veel meer metabolieten dan vandaag gekenmerkt een belangrijke regelgevende functie1 hebben. Metabolieten kunnen fungeren als biologische schakelaars, wijzigen van de activiteit, functionaliteit, en/of de lokalisatie van hun receptor eiwitten2,3,4. In het laatste decennium geweest verschillende doorbraak methoden, waardoor identificatie van PMI in vivo of in de omgeving vanin-vivo voorwaarden, ontwikkelde5. Beschikbare benaderingen kunnen worden gescheiden in twee groepen. De eerste groep bestaat uit technieken die met een bekende-metaboliet aas beginnen om te val roman eiwit partners. Methoden omvatten affinity chromatografie6, drug affiniteit responsieve doel-stabiliteit assay7, chemo-proteomics8en thermische Proteoom profilering van9. De tweede groep bestaat uit een enkele methode die met een bekende eiwit begint teneinde kleine-molecuul liganden10,11.
AP in combinatie met MS gebaseerde jachtgeweerlipidomics werd gebruikt voor het analyseren van eiwit-lipide complexen in Saccharomyces cerevisiae12. Als uitgangspunt, de auteurs gebruikt giststammen 21 enzymen die betrokken zijn bij biosynthese van ergosterol uitdrukken en 103 kinases gesmolten tot een zuivering van de tandem-affiniteit (TAP) label. 70% van de enzymen en 20% van de kinases bleken te binden verschillende hydrofobe liganden, vergieten van licht in het ingewikkelde eiwit-lipide interactie netwerk.
Voorheen konden we aantonen dat eveneens aan lipiden, polar en semi-polaire verbindingen ook gebonden aan eiwitcomplexen geïsoleerd van de cellulaire lysates13 blijven. Op basis van deze bevindingen, hebben we besloten voor het optimaliseren van de AP-methode, gepubliceerd eerder10,,11 voor plantencellen en hydrofiele stoffen14. Voor dit doel gebruikten we TAP vectoren beschreven door Van Leene et al. 2010, met succes gebruikt in de plant PPI studies15. We besloten om te verkorten van de benodigde tijd voor het verkrijgen van transgene lijnen, Arabidopsis celculturen. Wij werken een one-step methyl- tert-butylether, (MTBE) / methanol/water extractiemethode, waardoor de karakterisatie van eiwitten (korrel), lipiden (organische fase) en hydrofiele metabolieten (waterige fase)16 in één affiniteit-zuivering experiment. EV control lijnen werden geïntroduceerd om uit te sluiten van valse positieven, bijvoorbeeld eiwitten binden aan de tag alleen. Als bewijs van concept we gelabeld drie (van de vijf) nucleoside (III) difosfaat kinases presenteren in het Arabidopsis genoom (NDPK1-NDPK3). Onder andere bevindingen, kunnen wij laten zien dat NDPK1 met glutathione S communiceert-transferase en glutathion. Bijgevolg kunnen wij bewijzen dat NDPK1 is onderworpen aan glutathionylation14.
Kortom, het gepresenteerde protocol is een belangrijk instrument voor het karakteriseren van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine-molecuul interactienetwerken en vormt een belangrijke vooruitgang over bestaande methoden.
De gepresenteerde protocol kunnen parallelle identificatie van PP en PM complexen van een doel-eiwit. Van klonen te eindresultaten, kan het experiment worden afgerond in minder dan 8-12 weken. Volledige AP duurt ongeveer 4-6 h voor een set van 12 tot en met 24 monsters, waardoor ons protocol geschikt voor mid doorvoer analyse.
Het protocol, ondanks het feit dat over het algemeen eenvoudig, heeft een aantal kritische stappen. (i) voldoende hoeveelheid input eiwitten en affiniteit kralen is cruciaal voor het bereiken van een dynamisch scala aan metaboliet detectie. Efficiënte cellysis is daarom een essentiële stap in de procedure. Slechte eiwit opbrengsten kunnen een gevolg zijn van onvoldoende verpulvering van het materiaal of van de verhouding tussen suboptimaal lysis-buffer/materiaal. (ii) moet worden gezorgd dat gebruikte reagentia MS-vriendelijk zijn. Agressieve schoonmaakmiddelen, glycerol, of grote hoeveelheden zout moeten worden vermeden als zij met MS detectie interfereren. (iii) Agarose kralen mag niet overdreven gedroogde tijdens het wassen stappen, en bij het gebruik van een vacuüm variëteit is het belangrijk een langzame stroming tarief zo niet te vernietigen de kralen of complexe stabiliteit beïnvloeden toe te passen.
Er zijn enkele belangrijke eventuele wijzigingen in het gepresenteerde protocol: (i) We de constitutieve promotor van de CaMV35S gebruiken om de hoeveelheid aas eiwit te maximaliseren. Overexpressie, kan terwijl zeer nuttig, ernstige gevolgen hebben voor cel homeostase28 en leiden tot de vorming van fysiologisch irrelevant interacties. Expressie van tagged eiwitten met behulp van inheemse initiatiefnemers en waar mogelijk op de achtergrond van een verlies-van-functie wordt beschouwd als superieur voor ophalen waar biologische interactors. Voor de eiwitten die normaal niet uitgedrukt in celculturen plant, kan een plant achtergrond noodzakelijk blijken om te identificeren van relevante interactors. (ii) bij het werken met membraaneiwitten, moet de lysis-buffermengsel worden aangevuld met een MS-compatibele wasmiddel. (iii) invoering van een tweede affiniteit-zuivering kan verbeteren van vals-positieven te waar-positieven verhouding en elimineren de noodzaak voor EV besturingselementen29. Een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites presenteert een aantrekkelijk alternatief voor de grootte-uitsluiting chromatografie-stap toegevoegd door Maeda et al. 201411, die zowel moeizaam en tijdrovend is.
Het grootste nadeel van de AP is de hoge mate van valse positieven. De redenen zijn talrijk. Constitutieve overexpressie werd reeds genoemd. Een andere bron van fysiologisch irrelevant interacties, is tenzij werkt met geïsoleerde organellen, voorbereiding van geheel-cel lysates met mengsels van eiwitten en metabolieten van verschillende subcellular compartimenten. Subcellular Localisatie moet worden gebruikt om te filteren op ware interactors. Niettemin is de meerderheid van de valse positieven leiden tot van aspecifieke binding tussen eiwitten en agarose harsen. Introductie van een tweede zuivering, zoals hierboven beschreven, biedt de beste oplossing voor het probleem, maar gaat ten koste van tijd en doorvoer. Bovendien kan zwakkere interactie worden verloren als het protocol verlengt. Een andere valkuil van AP is dat ondanks de uitgebreide informatie over de interactome voor een doel-eiwit, onderscheid tussen directe en indirecte doelstellingen van het aas-eiwit is het onmogelijk. Gerichte bimolecular benaderingen zijn nodig om te bevestigen van interacties.
AP in combinatie met MS gebaseerde metabolomica werd gebruikt bij het bestuderen van eiwitcomplexen in S. cerevisiae12. Dit werk, samen met onze eerdere observatie13 dat ook lipiden, polar en semi-polaire verbindingen gebonden aan eiwitcomplexen afgezonderd van cellulaire lysates blijven, voorziet het voorgestelde protocol conceptuele basis. Ons protocol wordt gekenmerkt door drie unieke punten: (i) In tegenstelling tot de gist werken12, het toont aan dat AP is geschikt voor het ophalen van niet alleen hydrofobe maar ook hydrofiele proteïne liganden. (ii) door de invoering van een drie-in-één extractie-protocol, kan een enkele AP te bestuderen van eiwitten en metaboliet interactors van het aas-eiwit worden gebruikt. (iii) wij het protocol plantenziekterisico cellen aangepast.
Toekomstige inspanningen zal zich richten op het creëren van een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites. Wij zouden ook graag verkennen van geschiktheid van het protocol voor lage-overvloed kleine molecules zoals plantenhormonen.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen vriendelijk erkennen Prof. Dr. Lothar Willmitzer voor zijn betrokkenheid bij het project, productieve discussies en grote toezicht. Wij zijn dankbaar aan Dr Daniel Veyel voor het helpen met proteomic MS metingen. Wij waarderen Mrs. Änne Michaelis die ons onschatbare technische hulp met LC-MS-metingen. Bovendien wil wij Dr. Monika Kosmacz en Dr. Ewelina Sokołowska bedanken voor hun hulp en hun betrokkenheid bij het werk op het originele manuscript en tot Weronika Jasińska voor technische ondersteuning.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |