秀丽线虫生殖的计算分析研究细胞核、蛋白质和细胞骨架的分布
Summary
我们为秀丽线虫生殖提供三维重建的自动方法.我们的方法确定生殖中每个核的数量和位置, 并分析生殖蛋白质分布和骨架结构。
Abstract
秀丽线虫(C. 线虫) 生殖用于研究几个生物学上重要的过程, 包括干细胞发育、细胞凋亡和染色体动力学。虽然生殖是一个很好的模型, 分析往往是二维由于时间和劳动力需要的三维分析。这些研究的主要读数是生殖中细胞核和蛋白质分布的数量/位置。在这里, 我们提出了一个方法来执行生殖的自动分析使用共焦显微镜和计算方法, 以确定核在每个区域的生殖的数量和位置。我们的方法还分析了生殖蛋白的分布, 使三维检测的蛋白质表达在不同的遗传背景。此外, 我们的研究显示在生殖的不同区域骨架体系结构的变化, 可以适应特定的空间发展要求。最后, 我们的方法可以自动计数的精子在每个生殖的蝗受精囊。结合起来, 我们的方法实现了对C. 线虫生殖的快速和可重现的表型分析。
Introduction
与哺乳动物的信号通路守恒使线虫成为研究多个生物过程的优秀模型1,2。在实验室中, 我们使用线虫生殖研究干细胞的发育、凋亡和基因表达。虽然生殖是一个三维结构, 但由于三维分析的耗时和劳动密集型性质, 许多研究是二维的。二维分析极有可能会在生殖中歪曲体内事件。C. 线虫成体雌雄同体有两个生殖臂, 每个手臂都有一个躯体远端尖端细胞 (DTC), 在未分化状态3,4中维持远端生殖细胞。这些生殖细胞开始分化, 因为它们离开 DTC, 逃避其影响, 并成为卵母细胞和精子, 因为它们到达生殖的近端。在此过程中, 生殖细胞核发生有丝分裂, 然后过渡到减数分裂5,6。精子生产由发育的幼虫阶段 4 (L4) 完成, 之后卵母细胞在成年期间产生。精子储存在蝗受精囊卵母细胞中, 以生成胚胎。
有多种遗传和环境因素可以影响线虫中的生殖发展, 导致细胞核数量、凋亡事件数、染色体动态、蛋白质表达和/或定位的变化7 ,8,9,10,11。对这些事件的分析需要确定基于核形态和分布的各个分化阶段。要用大量的样本量手动准确地分析这些参数, 是劳动密集型和耗时的。为了规避这些缺点, 并使分析的一致性, 我们开发了一种自动化的方法, 三维检查的线虫生殖核计数, 核分布, 蛋白质表达, 和骨架结构。将共焦显微术与三维渲染相结合, 生成了粒度和形状参数, 用于鉴定生殖细胞分化的各个阶段。此外, 这种方法可以计数的生殖细胞核和精子加评分的染色体数在每个卵母细胞。
生殖的一个关键结构是骨架, 它提供了生殖室的稳定性, 艾滋病细胞质流和保护生殖核12。利用计算渲染, 我们对生殖细胞骨架进行了三维重建, 并在生殖中发现了明显的骨架特征。在这里, 我们描述了一步一步的协议, 以说明计算分析如何结合共焦成像, 使对C. 线虫生殖的综合分析。
我们提出了一个快速的方法, 三维分析线虫生殖 (图 1)。利用三维分析, 可以研究生殖核的三维分布 (图 2和图 3), 自动计数单元格 (图 2), 重建生殖骨架 (图 3), 蛋白质的分布 (图 4), 并评分卵母细胞中蝗受精囊和染色体中的精子数量(图 5)。该方法不仅能方便准确地量化生殖, 而且能识别生理上相关的表型。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议的目标是提高准确性, 减少生殖分析所需的时间。在解剖 germlines 的标准制备后, 通过计算渲染, 制备了一个三维生殖核模型。在允许观测生殖核在空间中的分布时, 三维渲染计算了生殖特定区域的核数目。我们的方法的关键方面是准确定义的大小和形状参数的原子核。这取决于染色的清晰度和图像的放大倍数。通过与已发布的手动分析数据1进行比较, 我们确认了该方法的正…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢显微成像的技术支持。有些菌株是由由 NIH 研究基础设施项目 (P40 OD010440) 资助的秀丽遗传学中心提供的。这项工作得到了一所大学生物医学发现奖学金, 澳洲项目赠款 (GNT1105374), 澳洲高级研究金 (GNT1137645) 和 veski 创新研究金的支持: VIF 23 到罗杰波科克。
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
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