Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Comunicazione dell’organo–organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell’omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l’ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l’alimentazione^1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.

Drosophila melanogaster è emerso come un utile modello per lo studio della comunicazione dell’organo–organo. In insetti, molti processi fisiologici sono controllati dagli ormoni. I primi studi sulla crescita e metamorfosi di messa a fuoco utilizzato grossi insetti. In questi studi, la rimozione o il trapianto di organi specifici predisse l’esistenza Inter-dell’organo molecole di segnalazione; più tardi, ormone giovanile (JH), ormone protoracicotropo (PTTH) ed ecdisone erano biochimicamente purificata^3,4,5. Una grande famiglia di peptidi segnalazione intercellulare è pensata per essere coinvolti in vari eventi fisiologici durante il ciclo di vita dell’insetto^6,7. La maggior parte di questi peptidi agiscono su recettori accoppiati a proteine G (GPCR), anche se i GPCR specifici erano inizialmente difficili da identificare mediante approcci convenzionali. La pubblicazione dell’intero genoma della drosofila sequenza⁸ è stata la svolta che ha permesso l’identificazione di peptidi bioattivi di Drosophila basato su loro omologia a quelli trovati in altri insetti. Inoltre, i recettori per i peptidi diversi sono stati identificati da GPCR preveduto nel genoma usando analisi di associazione GPCR-ligando cell-cultura-based. Successivamente, analisi di espressione predetto le vie dell’organo–organo suscitate da questi peptidi e recettori. In particolare, molti dei ricevitori del peptide putativo sono espressi nel cervello, suggerendo che il cervello è un obiettivo importante di peptide ormoni⁹. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati in Drosophila hanno contribuito all’identificazione di ruoli fisiologici di combinazioni peptide-GPCR. Ad esempio, i sistemi trascrizionale binari LexA e GAL4 abilitare gene atterramento o sovraespressione in maniera controllata spazialmente e temporalmente. Gal4, un fattore di trascrizione identificato in lievito, si lega a una specifica sequenza di cis-regolatori chiamata sequenza di attivazione a Monte (UAS). Nel sistema GAL4/UAS, la riga di driver fornisce tessuto-specifica o espressione GAL4 fase-specifici e la linea di risponditore trasporta UAS a Monte del gene di interesse o il costrutto all’espressione di shRNA in auto. LexA/LexAop sistema è basato su un meccanismo simile. Analisi fenotipiche di animali di GPCR-atterramento di peptide-atterramento e tessuto-specifico tessuto-specifici possono rivelare informazioni sulla modalità di segnalazione di peptide-GPCR e sito di azione. Tuttavia, le conclusioni che possono essere raggiunto esclusivamente da dati genetici sono limitate. D’altra parte, una volta che il bersaglio putativo di un ormone peptidico particolare viene ristretto a un tipo di tessuti o cellule, ex vivo calcio imaging in espianti di organo utilizzabile per delucidare la comunicazione dell’organo–organo mediata dalla segnalazione del peptide-GPCR. Al momento dell’attivazione di un GPCR accoppiati a Gq, concentrazione intracellulare di Ca^{2 +} è aumentata a causa del rilascio di Ca^{2 +} dal ER¹⁰. Nel cervello, attivazione neurale anche eleva i livelli di Ca^{2 +} intracellulari. Tali aumenti di Ca^{2 +} possono essere rilevati da un sensore di calcio, GCaMP, che subisce cambiamenti conformazionali in presenza di Ca^{2 +} con conseguente emissione di fluorescenza¹¹.

In questo articolo, viene descritto un metodo di imaging utilizzando il cervello di Drosophila espianti di calcio. Per testare la capacità di un peptide di attivare specifici neuroni, un peptide di prova viene applicato per l’espianto di cervello GCaMP-esprimendo, e cambiamenti di fluorescenza sono controllati mediante microscopia confocale. Il coinvolgimento dei GPCR viene confermato eseguendo la stessa analisi utilizzando un mutante cervello manca il GPCR. Questa combinazione di immagine e genetica fornisce informazioni precise sulla comunicazione dell’organo–organo di peptidi-GPCR. eventuali modifiche e applicazioni del presente protocollo inoltre sono discussi.