Summary

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

Published: June 19, 2018
doi:

Summary

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

Abstract

많은 양의 기능 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 심장 창시자의 정의 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 세대 셀 기반 심장 치료 및 질병 모델링에 대 한 필수입니다. 우리는 최근 Id 유전자는 필요 하 고 척추 개발 하는 동안 첫 번째 심장 필드 창시자 지정 하려면 충분 한 나타났습니다. 이 분화 프로토콜 이러한 연구 결과 활용 하 고 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 창시자를 생산 하 강력한 지정 큐로 Activin A와 함께에서 Id1 overexpression를 사용 합니다. 중요 한 것은, 결과 창시자 효율적으로 심 실 같은 cardiomyocytes에 (~ 70-90%)를 구분합니다. 여기는 1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs 2) 차별화 cryopreservable FHF L 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 확장 가능한 수량을 상세한 방법에 설명 합니다.

Introduction

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 대규모 생산-파생된 심장 창시자 및 cardiomyocytes는 줄기 세포 기반 요법1,2,3 와의 빠른 특성을 모델링 하는 질병에 대 한 필수 새로운 통로 규제 심장 차별화4,,56 과 생리학7,8. 비록 연구9,10,11,12,,1314의 번호,15 는 앞에서 설명한 고효율 심장 차별화 프로토콜 hPSCs에서, 아무도 중요 한 분자 차이 왼쪽의 식별도 결과 cardiomyocytes의 심장 필드 근원 해결 (첫 번째 심장 분야) 및 오른쪽 (두 번째 심장 분야) 심 실 cardiomyocytes16 과 심장 분야 특정 선 천 성 심장 질환;의 존재 즉, hypoplastic 좌 심 혼 증후군17 또는 arrhythmogenic 오른쪽 심 실 발육 이상18. 따라서, 심장 창시자의 생성 및 hPSCs에서 정의 된 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 되고있다 치료로 그들의 관련성을 증가 하기 위하여 필요성 및 질병 모델링 도구.

이 프로토콜의 Id1, 최근 확인 된5 첫 번째 심장 필드 지정 큐 필요 하 고 충분 한 hPSCs에서 cardiogenesis를 시작 하는 Activin A와 함께에서 하는 제정 overexpression에 의존 합니다. 특히, 커닝 햄 외. (2017) 5 표시는 Id1 유도 창시자 구체적으로 표현 첫 심장 필드 (HCN4, TBX5) 하지만 하지 두 번째 심장 필드 마커 (SIX2, ISL1) 그들은 심장 차별화를 받 다. 또한, 저자는 또한 표시 유전자 변형 마우스 배아의 유전자 (i d 14), 전체 Id 가족 부족 첫 심장 필드 심장 창시자, 더 많은 중간과 뒷부분 심장 창시자 (동안 형성 없이 개발 두 번째 심장 필드) 아직도 그로 인하여 Id 단백질 필수적인 첫 번째 심장 필드 cardiogenesis에서 vivo에서시작 하는 제안, 형성할 수 있다. 편리 하 게, Id1 유도 창시자 cryopreserved 수 고 저절로 cardiomyocytes 표시 심 실 같은 특성을 포함 하 여 심 실 전용 마커 (IRX4, MYL2) 식으로 차별화 하 고 같은 심 실 활동 전위.

여기는 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes Id1 overexpressing hPSCs에서 생성 하는 간단 하 고 확장 가능한 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜의 중요 한 특징은 편리한 cryopreservation 단계를 사용 하 여 후속 cardiomyocyte 생산에서 심장 조상 세대 연결을 푸십시오 가능성. 요약 하자면,이 프로토콜 (1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs, (2) hPSCs에서 FHF L 심장 창시자를 생성, (3) cryopreserve 결과 창시자, 및 (4) 재개 FHF L 심장 조상 차별화에 필요한 단계를 자세히 설명 하 고 생성 매우 농축 (> 70-90%) 심 실 같은 cardiomyocytes 박동.

Protocol

1. Id1 바이러스 준비 및 감염 공동 transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, 및 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR Id1 overexpressing lentivirus 생성 (Addgene: 플라스 미드 #107735) HEK293T 세포로. 바이러스 성 입자를 수집 하 고, 여과 하 고, 상쾌한에서 정화 하 고 무라 외 에서-80 ° C에서 저장 (2003) 19. 또는 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR lentivirus 생산 공급 업체에 전송 하 여 Id1 lentivirus를 상업적으로 생산.주의: lentiviral ?…

Representative Results

HPSCs의 생성 I d 1 라인hPSCs 중재 Id1 overexpression (그림 1A) lentivirus 감염 됩니다. HPSCId1 생성 됩니다 일단 transgene 식 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 정량입니다. 그 GAPDH 0.005 배 보다 높은 레벨에서 Id1 mRNA 표현으로 하는 hPSCId1 선만 차별?…

Discussion

성공적인 차별점에 대 한 밀접 하 게 지침에 따라 위에 나열 된 확인 합니다. 또한, 여기 우리가 강력 하 게 차별화 결과 영향을 주는 주요 매개 변수 강조 표시 합니다. 감 별 법을 시작 하기 전에 다음 세 개의 매개 변수 형태를 관찰 해야 합니다: hPSCsId1, 높은 세포 압축 및 높은 합류의 줄기 형태 (> 90%) 0에서 문화. 그런 측면에서 최적의 차별화 조건 단일 세포로 도금 해리 hPSCsi d 1

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 유용한 토론 Colas 실험실의 구성원 및 원고의 중요 한 리뷰 감사합니다. 이 연구는 NIH/NIEHS R44ES023521-02에 의해 지원 되었다 고 CIRM DISC2-10110 박사 Colas를 부여 합니다.

Materials

ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o – insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o – vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

Referências

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Citar este artigo
Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

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