Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau qui enquête et réagissent à la physiologie du cerveau altéré par des modifications morphologiques qui peuvent être évalués quantitativement. Ce protocole décrit un ImageJ base protocole d’analyse pour représenter la microglie morphologie comme continue des données selon des indicateurs tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme.
Les microglies sont des phagocytes de cerveau qui participent à l’homéostasie du cerveau et d’enquête en permanence leur environnement pour dysfonctionnement, les blessures et la maladie. Comme les premiers intervenants, la microglie ont des fonctions importantes pour atténuer la dysfonction neurone et cellule gliale, et dans ce processus, ils subissent un large éventail de modifications morphologiques. La microglie morphologies peuvent être classés de manière descriptive ou, alternativement, peuvent être quantifiés comme une variable continue des paramètres tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme. Méthodes pour quantifier les cellules microgliales sont appliquées à des cellules individuelles, peu de techniques s’appliquent aux multiples microglies dans un ensemble photomicrographie. Cette méthode vise à quantifier les multiples et des cellules individuelles à l’aide de protocoles de ImageJ facilement disponibles. Ce protocole est un résumé des étapes et plugins ImageJ recommandé pour convertir les images binaires et squelettisés représentant photomicrographies fluorescence et lumineux-zone et de les analyser à l’aide de logiciels plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) et FracLac pour la collecte de données de morphologie. Les sorties de ces plugins résument la morphologie cellulaire en ce qui concerne les points finaux de process, jonctions et longueur ainsi que complexité, la forme des cellules et des descripteurs de taille. Le protocole d’analyse squelette décrit ci-après est bien adapté pour une analyse régionale des microglies multiples au sein d’un ensemble photomicrographie ou d’une région d’intérêt (ROI), tandis que FracLac fournit une analyse de cellules individuelles complémentaires. Combinés, le protocole prévoit un objectif, un outil d’évaluation sensibles et complète qui peut être utilisé pour stratifier entre microglie diverses morphologies présentes dans le cerveau en bonne santé et blessé.
La microglie ont une réponse morphologique immédiate et diverse altérations dans cerveau physiologie1 selon un continuum de possibilités allant de morphologies hyper-ramification et extrêmement complexes aux morphologies hors ramifiés et amiboïdes2 . La microglie peut-être aussi devenir polarisée et bâtonnets3. Ramification de cellules de la microglie est communément définie comme une forme complexe ayant plusieurs processus et est souvent rapportée que le nombre de points de terminaison par cellule et la longueur des prolongements cellulaires. Puisque les microglies sont finement réglé à fonction neuronale et gliale et cellules continue diaphonie et in vivo la motilité4,5, microglie morphologies pouvant servir comme indicateurs de fonctions cellulaires variés et dysfonctionnements dans le cerveau. Une approche quantitative est nécessaire pour décrire adéquatement la diversité de ces modifications morphologiques et de distinguer les différences entre les cellules ramifiées qui se produisent avec subtiles perturbations physiologiques (tels que l’épilepsie5,6 et7de la commotion cérébrale) en plus de blessures brut (par exemple, accident vasculaire cérébral,8). Une utilisation accrue de morphologie quantification7,8,9,10,11,12,13,14 révélera toute la gamme des microglies morphologies au cours de la santé et la maladie. La présente étude détails l’utilisation progressive des plugins ImageJ nécessaire de résumer les microglies morphologie de fluorescents ou non fluorescent photomicrographies des microglies acquis dans les tissus de rongeurs fixe après l’immunohistochimie (IHC).
Centrale pour les techniques d’analyse décrites ici sont le ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, développé en 2010 afin de quantifier les grandes structures mammaires et FracLac16, développé en 2014 pour intégrer l’analyse ImageJ et fractale à quantifier les formes individuelles de la microglie. Ces plugins fournissent une analyse rapide de la ramification de la microglie dans photomicrographies entières ou plusieurs cellules microgliales d’un retour sur investissement défini dans une microphotographie. Cette analyse peut être utilisée seul ou en complément avec l’analyse fractale. L’analyse fractale de cellule unique (FracLac) nécessite un investissement de temps mais offre plusieurs sorties de morphologie au sujet de la complexité de la microglie, forme et taille. L’utilisation de ces deux outils n’est pas superflue, comme cellule de ramification est complémentaire à la complexité de la cellule et la combinaison de plusieurs paramètres peut-être servir à distinguer les microglies diverses morphologies dans datasets12,17.
Les cellules de la microglie sont finement accordées à la physiologie et la pathologie au sein de leurs micro-domaines et affichent un large éventail de morphologies2 fois subtiles7,14 et blessures brut8. L’utilisation de protocoles ImageJ rend quantification de la morphologie de la microglie accessible à tous les laboratoires comme plate-forme et plugins sont un logiciel de traitement d’images open source. Si le protocole décrit se concentre sur le traitement de l’image et l’analyse à l’aide de ce logiciel, l’uniformité de la collecte des données, la validité et la fiabilité commence par l’excellent IHC et microscopie. Ce protocole est utilisé pour améliorer le binaire, squelette et représentations contour des microphotographies ensemble et cellules individuelles mais ne peut pas prendre la place de pauvres IHC coloration et microscopie qui aboutit à faible contraste, floue ou déformée des images. Comme une autre considération, il faut ne pas d’aplatir le tissu cérébral pendant l’entreposage, avant incision, qui affecte irrévocablement la morphologie de la microglie. Enfin, au sein de chaque expérience, les microglies doivent être copié à l’aide de la même échelle, mais aussi le même microscope. Instrumentation, objectifs et logiciels varient de microscopes qui entraînera les photomicrographies tailles différentes malgré des objectifs similaires et changer le détail ainsi que le nombre de cellules au sein de chaque trame. Par exemple, acquisition d’images à l’aide d’un objectif X 40 sur un Leica SPII entraîne deux fois le nombre de cellules et moins de détails que l’acquisition à l’aide d’un Zeiss 880. Cela est particulièrement important pour les données de ramification des cellules prélevées dans l’ensemble du cadre plutôt que d’une seule cellule, comme cela devient une question d’échantillonnage des données.
En règle générale, analyse du squelette qui utilise la photomicrographie entière précède l’analyse fractale de cellule unique pour deux raisons. Ramification de cellule déterminant de toutes les cellules dans une microphotographie est rapide lorsque comparée à l’analyse fractale de cellule unique et peut être considérée comme un outil de dépistage si le temps est un facteur. En outre, les images binaires au cours de l’analyse de squelette sont utilisées pour analyse fractale. Une fois l’image, il y a un certain nombre d’étapes critiques qui peuvent influencer les résultats de l’analyse de squelette et introduire l’utilisateur-influence. Les étapes du protocole qui sont plus variable entre les utilisateurs ce sont l’étape 4.2 (luminosité croissante de l’image) et 4.5 (déterminer le seuil). Si possible, un nombre optimal pour augmenter la luminosité (curseur max ou min entre 0 et 255) est déterminé et maintenu constant pour toutes les images et les utilisateurs. Lorsque la variabilité de l’image est grande, l’utilisateur peut choisir à la place une luminosité qui variera entre les images. Par ailleurs, si les images sont lumineuses et le contraste est élevé, puis augmentation de luminosité peut être omis et seuillage peut être normalisée à l’aide d’un filtre de seuil de spécialité (e.g., Huang) plutôt que la valeur par défaut plus variable. Une fois optimisées, les paramètres doivent être respectées afin de minimiser l’influence utilisateur supplémentaire.
Un exemple de la variabilité de l’utilisateur est présenté dans la Figure 5. Valeurs de données ont augmenté à 1 utilisateur par rapport à l’utilisateur 2 et donc variabilité augmenterait si les utilisateur 1 et utilisateur 2 a contribué à la collecte de données. Un exemple des différences dans l’utilisateur 1 et utilisateur 2 des images binaires et squelettisés sont soulignées par des cercles colorés (Figure 5). Dans ce cas, les deux utilisateurs ont été brièvement formés étudiants de premier cycle ayant une expertise limitée dans la microglie. Surveillance régulière et l’encadrement par une expert avec protocole accrue d’entraînement2 la microglie peuvent réduire la variabilité inter-utilisateur. Bien que non évalués ici, analyse fractale est moins sujette à la variabilité inter-utilisateur parce que les cellules binaires sont manuellement et individuellement isolées d’une microphotographie, plutôt que de compter uniquement sur seuillage afin de déterminer les formes de la microglie. Cependant, toutes les méthodes possèdent une variabilité entre les utilisateurs. Par conséquent, un seul utilisateur (idéalement, formé par une expertise dans les cellules de la microglie) devrait terminer la collecte de données pour un dataset entier.
Modifications supplémentaires peuvent être facilement apportées à ce protocole et dépendront de la qualité d’image et les efforts déployés pour réduire le bruit et assurer la connectivité de processus. Par exemple, si le contraste est suffisant, puis masque flou n’est pas nécessaire et peut être omis. Il est prudent de les optimiser et finaliser le protocole pour un ensemble spécifique d’images, tant cas expérimentaux et témoins, avant de collecter des données d’un jeu entier. Enfin, les plugins supplémentaires peut être utilisé en lieu et place d’autres pour clarifier ou aiguiser les images qui n’étaient pas décrits dans le présent protocole tels que dilater ou aiguiser.
Avantages du présent protocole sont sa disponibilité universelle et son adaptabilité. En outre, évaluer la ramification de cellule à l’aide de AnalyzeSkeleton est rapide et applicable à un ensemble photomicrographie. Des avantages de l’approche de l’analyse de plusieurs cellules sont l’accent mis sur une région entière plutôt que des cellules individuelles. Par conséquent, il est possible d’évaluer rapidement la ramification moyenne (en termes de points de terminaison et la longueur du processus) de toutes les cellules microgliales au sein de l’image. Squelette analyse fournit une analyse de plusieurs cellules : un échantillon de données en termes de nombre de cellules qui ne peut être égalé par analyse fractale en raison de l’investissement de temps nécessaire pour isoler des cellules individuelles de photomicrographies. Une instance où cela pourrait être mieux adapté serait dans le dépistage des microglies morphologies à proximités d’une lésion focale. Une des limites est le rendu d’image de tout le domaine pour créer des modèles de squelette de microphotographies IHC est imparfait par rapport à l’approche de cellule unique beaucoup plus de temps. En outre, une analyse de la région n’est pas appropriée aux circonstances où les microglies morphologies sont radicalement différents dans le même champ. Enfin, cette méthode d’analyse est tributaire du nombre de cellules, un paramètre qui peut-être différer entre les conditions expérimentales.
Analyse fractale se déroule sur une seule cellule et complète donc la sortie de données de ramification moyenne des cellules issues de l’analyse du squelette. Bien que beaucoup plus de temps consommé, cet investissement donne un large éventail de données morphométriques. Par exemple, la cellule densité, span ratio, et données de circularité décrivent, élongation, forme et la taille de l’esquisse de la cellule, respectivement. Lacunarité et dimension fractale résument la complexité de la cellule et l’hétérogénéité de la forme, respectivement. On trouvera un résumé plus approfondi de la manière dont chaque paramètre est calculé et comment les données peuvent être interprétées dans le manuel interactif16 et les détails sont à considérer en ce qui concerne la question spécifique de recherche. Les résultats du protocole décrit dans les outils sensibles pour quantifier les petits changements dans les morphologies des microglies 2D qui peuvent survenir dans des conditions physiologiques et pathologiques. L’analyse morphométrique supplémentaires tels que la solidité, convexité et facteur de forme16,20 peut être possible si génère des formes 3D.
Adaptation et développement de protocole est continue et axée sur l’utilisateur. Il a été étendu de fluorescence8 à DAB/lumineux-zone images7 , mais pas encore pour tissus incorporé de paraffine. On outre, il peut être utilisé en conjonction avec des logiciels propriétaires comme Imaris pour analyse complémentaire. Ce protocole peut être appliqué à une variété de physiologie et n’est pas limité dans la microglie mais peut être appliqué à toute cellule ou tissu avec motifs particuliers ou des formes qui peuvent être identifiés à l’aide de méthodes IHC. Enfin, avec la taille de l’échantillon suffisant, une analyse multivariée ou cluster peut être appliquée pour stratifier des microglies selon morphologie12,21; Il s’agit d’informations utiles comme la morphologie de la microglie est un indicateur essentiel des fonctions de microglie et des réponses à leur environnement. L’appréciation de la diversité morphologique microgliale est en expansion et important de bien comprendre les interactions neurone-glie-vasculaire au cours de la santé et la maladie. La croissance dans ce domaine est renforcée par des protocoles bien développés, facile à utiliser et reproductibles pour quantifier et résumer la microglie morphologie à l’aide de multiples variables continues.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a reçu le soutien financier de NINR (F32NR013611). Nous tenons encore à remercier les développeurs de AnalyzeSkeleton(2D/3D) et FracLac (Arganda-Carreras et coll. et Karperien et al., respectivement) sans laquelle l’analyse décrite dans les présentes ne serait pas possible.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |