Microglia zijn hersenen immune cellen die enquête en reageren op veranderde hersenen fysiologie via morfologische veranderingen die kwantitatief kan worden beoordeeld. Dit protocol schetst een ImageJ gebaseerd analyse protocol te vertegenwoordigen microglia morfologie als continu gegevens volgens de statistieken, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm.
Microglia zijn hersenen fagocyten die deelnemen aan de hersenen homeostase en voortdurend onderzoek hun omgeving voor dysfunctie, verwonding en ziekte. Als de eerste responders, microglia hebben belangrijke functies te verzachten neuron en glia dysfunctie, en in dit proces, zij een breed scala van morfologische veranderingen ondergaan. Microglia morphologies Samaraculturen kunnen worden gecategoriseerd en anderzijds kunnen worden gekwantificeerd als een continu variabele voor parameters, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm. Terwijl de methoden voor het kwantificeren van microglia worden toegepast op afzonderlijke cellen, toepassen paar technieken op meerdere microglia in een hele gekleurd. Het doel van deze methode is te kwantificeren van meervoudige en enkelvoudige cellen met behulp van gemakkelijk beschikbare ImageJ protocollen. Dit protocol is een samenvatting van de stappen en ImageJ plugins aanbevolen fluorescentie en helder-veld photomicrographs converteren naar representatieve binair en skeletonized beelden en te analyseren met behulp van software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) en FracLac voor de verzameling van de gegevens van de morfologie. De uitgangen van deze plugins samenvatten cel morfologie in termen van proces eindpunten, kruispunten, en lengte evenals complexiteit, cel vorm en grootte descriptoren. Het skelet analyse protocol hierin beschreven is geschikt voor een regionale analyse van meerdere microglia binnen een gehele gekleurd of de regio van belang (ROI) Overwegende dat de FracLac biedt een aanvullende individuele cel analyse. Gecombineerd, voorziet het protocol in een objectieve, gevoelige en uitgebreide beoordeling hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het stratificeren tussen uiteenlopende microglia morphologies aanwezig in de hersenen gezond en gewonden.
Microglia hebben een onmiddellijke en diverse morfologische reactie op veranderingen in de hersenen fysiologie1 langs een continuüm van mogelijkheden die variëren van hyper-restanten en zeer complexe morphologies-vertakte en Wortelpotigen morphologies2 . Microglia wellicht ook gepolariseerde en staafvormig3. Microglia cel restanten wordt meestal gedefinieerd als een complexe shape met meerdere processen en wordt vaak gemeld als het aantal eindpunten per cel en de lengte van de processen van de cel. Aangezien microglia zijn fijn afgestemd op neuronale en gliale functie t/m continu cel cross-talk en in vivo motiliteit4,5, kunnen microglia morphologies dienen als indicatoren van uiteenlopende cel functies en stoornissen in de hersenen. Een kwantitatieve benadering is nodig om voldoende beschrijven de diversiteit van deze morfologische veranderingen en het te onderscheiden van de verschillen tussen vertakte cellen die zich met subtiele fysiologische verstoringen (zoals epilepsie5,6 voordoen en hersenschudding7) naast bruto schade (zoals beroerte8). Een intensiever gebruik van morfologie kwantificering7,8,9,10,11,12,13,14 zal onthullen de volledige diversiteit van microglia morphologies tijdens gezondheid en ziekte. De huidige studie details de stapsgewijze gebruik voor ImageJ plugins nodig om samen te vatten microglia morfologie van TL of niet-belichting fluorescerende photomicrographs van microglia in vaste knaagdier weefsel na immunohistochemistry (IHC verworven).
Centraal aan de analysetechnieken die hier worden beschreven zijn de ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, ontwikkeld in 2010 tot grote borstklier structuren, kwantificeren en FracLac16, ontwikkeld in 2014 te integreren ImageJ en fractal analyse kwantificeren van individuele microglia vormen. Deze plugins bieden een snelle analyse van microglia restanten binnen de gehele photomicrographs of meerdere microglia van een gedefinieerde ROI binnen een gekleurd. Deze analyse kan alleen of in aanvulling met fractal analyse worden gebruikt. De eencellige fractal-analyse (FracLac) vereist een investering van tijd, maar biedt meerdere morfologie uitgangen met betrekking tot microglia complexiteit, vorm en grootte. Het gebruik van beide tools is niet overbodig, als cel restanten vormt een aanvulling op de complexiteit van de cel, en de combinatie van meerdere parameters kan worden gebruikt om te onderscheiden tussen uiteenlopende microglia morphologies binnen datasets12,17.
Microglia cellen zijn fijn afgestemd op de Fysiologie en pathologie binnen hun micro-domeinen en een breed scala van morphologies-2 weer te geven in zowel subtiele7,14 en bruto letsel8. Het gebruik van ImageJ protocollen microglia morfologie kwantificering toegankelijk maakt voor alle laboratoria als platform en plugins zijn een open-source software voor beeldverwerking. Terwijl het beschreven protocol is gericht op de beeldverwerking en de analyse met behulp van deze software, begint de consistentie van gegevensverzameling, geldigheid en betrouwbaarheid met uitstekende IHC en microscopie. Dit protocol wordt gebruikt om binaire, skelet, en overzicht representaties van de hele photomicrographs en afzonderlijke cellen te verbeteren, maar kan niet de plaats innemen van arme IHC kleuring en microscopie die resulteert in een laag contrast, wazig of vervormd beelden. Als een extra vergoeding, wees voorzichtig niet om plat van het hersenweefsel tijdens opslag, vóór het segmenteren, die onherroepelijk microglia morfologie verandert. Tot slot, binnen elk experiment, microglia moet worden beeld met behulp van dezelfde schaal, evenals de dezelfde Microscoop. Instrumentatie, doelstellingen en software verschillen onder microscopen die zal resulteren in verschillende grootte photomicrographs ondanks soortgelijke doelstellingen en wijzigen van de details, alsmede het aantal cellen binnen elk frame. Beeldacquisitie met behulp van een 40 X-doelstelling op een Leica SPII resulteert bijvoorbeeld in tweemaal het aantal cellen en minder detail dan overname met behulp van een Zeiss-880. Dit is vooral belangrijk voor cel restanten gegevens verzameld uit het gehele frame in plaats van een enkele cel, zoals dit een probleem voor de bemonstering van de gegevens wordt.
In het algemeen, skeleton analyse die gebruik maakt van de hele gekleurd wordt voorafgegaan door de eencellige fractal analyse om twee redenen. Bepalende cel restanten van alle cellen in een gekleurd is snel in vergelijking met de eencellige fractal analyse en kan worden beschouwd als een screening tool als tijd een factor is. Daarnaast worden de binaire afbeeldingen afgeleid tijdens de skeleton analyse gebruikt voor analyse van de fractal. Zodra het beeld, zijn er een aantal essentiële stappen die kunnen beïnvloeden skelet analyseresultaten en de invoering van gebruiker-invloed. Het protocol stappen die meeste variabel tussen gebruikers zijn zijn stap 4.2 (toenemende helderheid van de afbeelding) en stap 4.5 (bepalen van de drempel). Waar mogelijk, is een optimale nummer te verhogen van de helderheid (max of min schuifregelaar tussen 0-255) vastgesteld en constant voor alle afbeeldingen en gebruikers gehouden. Waar beeld variabiliteit groot is, kan de gebruiker in plaats daarvan een helderheid die tussen de afbeeldingen variëren zal kiezen. Als afbeeldingen licht zijn en contrast hoog is, dan meer helderheid kan worden weggelaten en drempelmethode kan worden herleid met behulp van een speciale drempel filter (bv., Huang) in plaats van de meer variabele standaard. Zodra geoptimaliseerd, de parameters moeten in acht worden genomen om het minimaliseren van extra gebruiker-invloed.
Een voorbeeld van de variabiliteit van de gebruiker is opgenomen in afbeelding 5. Gegevenswaarden in gebruiker 1 versus gebruiker 2 werden verhoogd en daarom variabiliteit zou worden verhoogd als zowel gebruiker 1 en 2 van de gebruiker aan het verzamelen van gegevens bijgedragen. Een voorbeeld van de verschillen in gebruiker 1 en gebruiker 2 binaire en skeletonized beelden worden aangegeven met gekleurde cirkels (Figuur 5). In dit geval waren beide gebruikers kort opgeleide studenten met beperkte expertise in microglia. Regelmatig toezicht en begeleiding door een deskundige samen met verhoogde protocol opleiding2 microglia kunnen verminderen tussen gebruiker variabiliteit. Hoewel hier niet beoordeeld, immers fractal analyse minder afhankelijk van Inter gebruiker variabiliteit binaire cellen zijn handmatig en individueel geïsoleerd van een gekleurd in plaats van te vertrouwen alleen op drempelmethode om microglia vormen. Echter bezitten alle methoden sommige variabiliteit tussen de gebruikers. Dus, een enkele gebruiker (in het ideale geval getraind door enkele expertise in microglia cellen) het verzamelen van de gegevens voor een gehele dataset moeten worden voltooid.
Extra wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gedaan om dit protocol en beeldkwaliteit, en alles in het werk verminderen lawaai en ervoor zorgen dat proces connectiviteit zal afhangen. Bijvoorbeeld, als contrast voldoende is, dan onscherp masker is niet nodig en kan worden weggelaten. Het is verstandig om te optimaliseren en het protocol voor een specifieke set van beelden, zowel experimentele gevallen en controles, vóór het verzamelen van gegevens uit een hele reeks af te ronden. Tot slot, extra plugins kan worden gebruikt in plaats van anderen te verduidelijken of verscherpen van afbeeldingen die niet werden beschreven in dit protocol zoals verwijden of verscherpen.
Voordelen van dit protocol zijn de universele beschikbaarheid en aanpassingsvermogen. Daarnaast, is beoordeling van de restanten van de cel met behulp van AnalyzeSkeleton snel en van toepassing op een gehele gekleurd. Een voordeel van meerdere cellen analyse aanpak is de focus op een hele regio in plaats van afzonderlijke cellen. Men kan dus snel beoordelen de gemiddelde restanten (in termen van eindpunten en proces lengte) van alle microglia binnen het besturingselement image. Skelet analyse geeft een analyse van meerdere cellen: een steekproef van de gegevens in cel aantallen die niet kunnen worden afgestemd door fractal analyse als gevolg van de investering van de vereiste tijd te isoleren van de afzonderlijke cellen van photomicrographs. Een exemplaar waar dit misschien wel geschikt zou zijn bij bevolkingsonderzoek microglia morphologies in proximities aan een focal verwonding. Een beperking is het hele veld beeldweergave om skelet modellen van IHC photomicrographs is onvolmaakt in vergelijking met de meer tijdrovend eencellige aanpak. Bovendien, is een regio-analyse niet overeenkomen met de omstandigheden waar microglia morphologies zijn drastisch anders binnen hetzelfde veld. Tot slot, deze analysemethode is afhankelijk van aantal cellen, een parameter die tussen experimentele omstandigheden verschillen kan.
Fractal analyse wordt uitgevoerd op een enkele cel en daarom is een aanvulling op de gemiddelde cel restanten gegevens output die voortvloeien uit de skeleton analyse. Hoewel veel meer tijd consumeren, deze investering een breed scala van Morfometrische gegevens levert. Bijvoorbeeld celdichtheid, span-verhouding, en cirkelvormigheid gegevens beschrijven de grootte, rek en vorm van de omtrek van de cel, respectievelijk. Fractale dimensie en lacunarity samen te vatten de cel Complexiteit en heterogeniteit van de vorm, respectievelijk. Een meer diepgaande samenvatting van hoe elke parameter wordt berekend en hoe gegevens kunnen worden geïnterpreteerd wordt verstrekt in de interactieve handleiding16 en zo gedetailleerd moet worden beschouwd met betrekking tot de specifieke onderzoeksvraag. Het beschreven protocol resulteert in gevoelige hulpmiddelen te kwantificeren pasmunten in 2D microglia morphologies die zich in fysiologische en pathologische omstandigheden voordoen kunnen. Extra Morfometrische analyse zoals degelijkheid en convexiteit16,20 van de factor van de vorm wellicht mogelijk als het genereren van 3D-vormen.
Protocol ontwikkeling en aanpassing is continu en gebruikersgerichte. Het is uitgebreid van fluorescentie8 DAB/helder-veld beelden7 , maar nog niet ingesloten weefsel paraffine. Het toevoeging, het kan worden gebruikt in combinatie met propriëtaire software zoals Imaris voor aanvullende analyse. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van fysiologie en is niet beperkt tot microglia maar naar een cel of een weefsel met bijzondere patronen of vormen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van IHC methoden kan worden toegepast. Tot slot, met voldoende grootte van de steekproef, een experiment met meerdere varianten of cluster analyse kan worden toegepast om te stratificeren microglia volgens morfologie12,21; Dit is nuttige informatie zoals microglia morfologie een belangrijke indicator van microglia functies en reacties op hun omgeving is. De waardering voor microglial morfologische diversiteit is groeiende en het belangrijk dat u volledig begrijpt neuron-glia-vasculaire interacties tijdens gezondheid en ziekte. Groei in dit veld wordt versterkt door goed ontwikkelde, makkelijk te gebruiken en reproduceerbare protocollen te kwantificeren en microglia morfologie met behulp van meerdere continue variabelen samen te vatten.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie kreeg financiële steun van de NINR (F32NR013611). Wij willen verder erkennen en dank de ontwikkelaars van AnalyzeSkeleton(2D/3D) en FracLac (Arganda-Carreras et al. en Karperien et al., respectievelijk) zonder dat de hierin beschreven analyse niet mogelijk zou zijn.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |