Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы
Summary
Здесь мы представляем organotypic культивирование протокол вырастить эмбриональные куриные органов в пробирке. С помощью этого метода, развитие эмбриона курицы ткани могут быть изучены, сохраняя при этом высокую степень контроля над окружающей среде культуры.
Abstract
Эмбриональные куриные обычно используется как организм надежная модель для развития позвоночных. Его доступность и короткий инкубационный период делает его идеально подходит для экспериментов. В настоящее время изучение этих путей развития в куриного эмбриона проводится путем применения ингибиторов и наркотики на локализованных участках и при низких концентрациях, с использованием различных методов. В vitro культивирования тканей — это метод, который позволяет исследование тканей, отделены от организм хозяина, минуя одновременно многих физических ограничений при работе с весь эмбрионов, например восприимчивость эмбрионов высокие дозы потенциально смертоносных химических веществ. Здесь мы представляем organotypic протокол для культивирования эмбриональные куриные половины головы в пробирке, который открывает новые возможности для изучения процессов развития за пределами в настоящее время установленных методов культивирования.
Introduction
Эмбриональные куриные (Gallus gallus) является организма отличную модель широко используется в области биологии. Ее инкубационный период составляет около 21 дней, и много яиц может быть инкубировали одновременно, делая эксперименты быстро и эффективно. Возможно самое главное, эмбрион также легко манипулировать, позволяя обширное исследование из ключевых процессов развития и генов и белков, которые управляют эти процессы.
Эмбриональные куриные глаз это сложный орган, который развивается через взаимодействия целого ряда различных тканях похож на многих других систем организма. Этот метод позволяет исследование развития этих тканей, особенно на поздних стадиях развития. К примеру многослойные сетчатки может быть особый интерес для тех, кто изучает развитие нервной системы. Альтернативные методы, позволяющие изучение других тканей глаза, такие как роговицы, тело vitreal, объектив, склера и веки пользу исследователей. Глаз эмбриональные куриные также содержит ряд плоских костей, склеры косточки, которые могут быть использованы в качестве модели для изучения intramembranous кости индукции и окостенения в позвоночных1.
В настоящее время существует целый ряд методов, используемых для изучения эмбрионального развития. Микроинъекции ингибирующее антител или других ингибирующее молекулы2,3, хирургически имплантированных микрошарики, пропитанной ингибитор4, и электропорации5 все методы, которые могут быть использованы для помощью генов или протеинов интереса в эмбрион. Подобные методы используются для upregulate белков. Эти методы не являются без их ограничения. Например, при использовании химических веществ изменять эмбрионального развития, должны быть оценены смертоносное воздействие на эмбрион, и это ограничивает использование вышеупомянутых методов локализованные сайты применения при дозах достаточно низким для обеспечения живучести эмбриона.
В vitro культивирования тканей используется в широком диапазоне организмов для изучения развития и может использоваться для обхода некоторых из вышеуказанных ограничений. К примеру бедрах6, перо бутоны7,8и9 конечностей курица все были изучены с помощью ткани, культивирование методы, как яичках мыши10 и корни и стебли растений11. Эти методы предоставляют ученые высокую степень контроля над развитием ткани, такие как способность к колебаниям температуры и изменять доступность питательных веществ. Изоляции ткани от всей эмбрионов также делает его гораздо меньше подвержены смертоносного воздействия химических веществ, таким образом позволяя манипуляции исследований в глобальном масштабе в более высоких концентрациях. Другим заметным преимуществом в vitro культивирование является сохранение ткани клеточной среды; расположение тканей остается относительно неизменным, что делает его возможным изучение взаимодействия между различными ткани типы9. Таким образом, в пробирке культивирования открывает двери для дополнительных экспериментальных подходов не доступны в естественных условиях или в ovo модели.
В настоящее время изучение развития эмбриона курицы глаза с помощью химических веществ является особенно сложным. Количество extraembryonic мембраны покрытия эмбриона, что делает его трудно применять микрошарики или химических веществ; эмбрион также очень активны в яйцо, как он становится старше, еще более усложняют метод уже трудно. Этот протокол позволяет легкий доступ для глаз и окружающих тканей, устранение этих барьеров, а также предоставляет новые возможности для изучения процессов развития в глаза. Этот протокол был создан для изучения индукции склеры косточки внутри эмбриона глаз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол использует установленные ткани, культивирование методы для достижения роста, курица глаза от эмбриональных день 8 (HH34) в vitro на 4 дня. Этот метод культивирования сетки первоначально был описан Trowell15. Мы оптимизировали протокол от Пинто и холл в 1991 исследова…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели поблагодарить Грегори Халлер (Маунт Сент Винсент университет) за его предварительную работу по разработке протокола. Авторы хотели бы также поблагодарить Николас Джонс (Университет Маунт Сент-Винсент) для его технического опыта и помощи с съемок и производства аудио визуальной части рукописи. Дэниэл Эндрюс был поддержан финансирование от МСВУ и естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) через награду исследования студент бакалавриата. Тамара а. Франц-Odendaal поддерживается грантом Сенти обнаружения.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
Referências
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Biologia do Desenvolvimento. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Biologia do Desenvolvimento. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
