유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

1980 년에 고 든 외 의 선구적인 작품 pseudopregnant 마우스에 이식 후 수정 된 oocytes의 남성 pronuclei 에 플라스 미드 DNA 주입 통합 유전자 변형 동물의 생산 얻을 수 있습니다 보여주었다는 플라스 미드 DNA¹. Transgenic 포유류를 생성할 수 있습니다 데모 모두 기본적인 과학 및 변환 생물 의학 연구의 새로운 분야에 길을 열어 글로벌 생명과학에 엄청난 영향을 했다. 지난 4 년간 DNA microinjection은 일상적인 연습 되었다. 유전자 변형 쥐의 거 대 한 수 제작 되었습니다, 하지만 표준 방법 모든 마우스 긴장에 대 한 완벽 하 게 사용할 수 이며 시간이 소요 backcrosses^2,3를 요구 한다. 다른 종에의 응용 도전⁴ 유적과 전반적인 transgene 통합 수익률 태어난된 동물⁵의 몇 %로 제한 됩니다. 또한, transgene 통합의 효능 pronuclear DNA 주입의 가난한 전체 수익률을 설명 하는 제한 요소를 나타냅니다. 이 점에서 통합 바이러스 성 벡터 화물을 가장 효율적인 도구 transgenes 통합 그리고 이렇게 크게 증가 통합 수확량, 유일한 제한은 transgene 크기를 10 kb^{6 초과할 수 없습니다 되 고 새로운 의미를 제공할 수 있습니다.} .

Lentiviral 벡터 의사 봉투 단백질 Vesicular 구내 염 바이러스 (VSV)의 형식의 pantropic 및 높은 통합 유전자 전송 도구 이며 transduce 수정 된 oocytes⁷을 사용할 수 있습니다. Zona pellucida 는 oocytes를 둘러싼 자연 바이러스 방 벽 고 lentiviral 벡터와 변환 있도록 전달 될 필요 합니다. 유전자 변형 동물 마이크로 드릴링 또는 zona pellucida^8,9의 제거 후 수정 된 oocytes 시험에 의해 생성 된 것. 그러나, zona pellucida perivitelline 공간에서 아래 주입 transduce 로이스와 동료⁷에서 처음 설명한 대로 수정 된 달걀을 간단한 방법으로 나타납니다.

Lentiviral 벡터의 perivitelline 주입 태어난된 동물의 70% 이상 유전자 변형 동물의 생산에 높은 수율을 수 있습니다. 이러한 수익률 표준 pronuclei DNA 주입^7,,1011를 사용 하 여 얻을 수 있는 최고의 수익률 보다 10 배 이상 높습니다. 이러한 맥락에서 주사의 단일 세션 50 유전자 변형 설립자 (F0)를 생성 합니다. 설립자의 다 수는, 그러므로, F0 생쥐 유전자 변형 마우스 라인을 생성 하는 필요 없이 직접 수행 transgene 효과의 형질과 호환. 이 장점은 transgene 효과의 신속한 심사 가능 하며 특히 적응 주 이내 vivo에서 이득과 손실의 기능 연구를 수행 하는. 또한, 규제 DNA 요소 수 있습니다 또한 빠르게 상영 지도 강화 및 녹음 방송 요인^11,12으로 DNA 주제에. Pronuclear 주사와 transgenes는 일반적으로 독특한 소재 시로 여러 복사본 통합. Lentiviral 벡터와 통합 로커 스^10,13당 단일 복사본으로 여러 loci에서 발생합니다. 따라서, 통합된 loci의 다양성 유전자 변형 설립자에서 관찰은 새로운 생성 된 모델을 더 강력한 시키는 매우 높은 식 penetrance에 관련 된 가장 가능성이 높습니다.

중요 한 것은, DNA의 pronuclear 주입을 사용 하 여, 절차 동안 pronuclei 의 시각화는 절대적으로 필요 합니다. 이 기술적 제한 수정 된 oocytes 마우스 긴장의 큰 다양성에서 발생의 사용을 방지 합니다. 따라서, 특정에서 유전자 변형 모델의 생산 뒤에 적어도 10 연속 backcrosses 원하는 마우스 transgene 전송 허용 스트레인에 동물의 생산을 필요는 pronuclei 표시 되지 않습니다 변형 스트레인입니다. Lentiviral 벡터 주사 perivitelline 공간은 항상 표시와 주사 매우 구체적인 기술이 필요 하지 않습니다. 예를 들어, pronuclei 주입에 적합 하지 않은 끄 덕/SCID 유전자 변형 쥐 바이러스 성 벡터 주사¹⁴로 얻은 되었습니다 있다.

여기, 포괄적인 프로토콜 lentiviral 벡터 주사 한 세포 단계 태아의 perivitelline 공간에를 사용 하 여 유전자 변형 마우스의 간단한 생산을 허용 하도록 제공 됩니다. Transgene 식으로 제어 유비 쿼터 스 또는 셀 특정 발기인 자세하게 설명 됩니다.

PTrip ΔU3 lentiviral 백본¹⁵이 연구 사용 되었다. 이 벡터는 U3 시퀀스 부분적으로 삭제 된 U3 발기인 활동을 제거 하 고¹⁶자기 inactivating 벡터 (죄) 생성 하는 복제 결함 lentiviral 벡터를 생산 수 있습니다. Lentiviral 벡터 주식 p8.91 캡슐화 플라스 미드 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV-G 인코딩 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 당단백질-G¹⁷및 pTRIP ΔU3와 HEK 293T 세포의 과도 transfection에 의해 제작 재조합 벡터입니다. 자세한 생산 절차 보완 방법으로 제공 됩니다.

생산의 높은 titer lentiviral 벡터 주식 Biosafety 수준 2 세 조건 (BSL-2)에서 수행 됩니다. 이 BSL-3에서 생산 해야 oncogenes 제외한 대부분 transgenes 마찬가지입니다. 따라서, 대부분의 경우 BSL-2 조건에서 생산은 충분 합니다. 또한, 사용 및 생산 일반적으로 끊어집니다 유전자 변형된 생물체 (GMO)을 다루는 대부분 국가 규제 기관에 대 한. 제한 된 양의 복제 무능 한 죄 lentiviral 벡터 (p24 capsid 단백질의 2 µ g) 아래 유럽 연합 권고와 프랑스 조합에 의해 설명 된 대로 BSL-1 조건에서 사용할 수 있습니다.