A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ
Summary
Этот протокол описывает, как подготовить олигомеров значения из синтетических пептидов в пробирке и оценить относительные количества значения олигомера, точка промокательной анализа.
Abstract
Β-амилоида (значения) – гидрофобная пептид с внутренней тенденцией самостоятельно собрать на агрегаты. Среди различных агрегатов значения олигомера широко признается в качестве ведущих нейротоксина в прогресс болезни Альцгеймера (AD) и считается важным событием в патогенезе AD. Таким образом, значения олигомера ингибиторов может предотвратить нейродегенеративные и имеют потенциал, чтобы быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Однако различные формирования протоколов олигомера значения может привести к олигомеров с различными характеристиками. Кроме того не есть много методов, чтобы эффективно экран значения1-42 олигомера ингибиторов. Антитело A11 может реагировать с подмножеством токсичных значения1-42 олигомера с β-лист анти параллельной структуры. В этом протоколе мы опишем, как подготовить пример олигомер богатые A11-положительные значения1-42 из синтетических значения1-42 пептида в пробирке и оценить относительные количества A11-положительные значения1-42 олигомера в образцах, точка промокательной анализ с помощью A11 и значения1-42-конкретные 6E10 антител. Используя этот протокол, ингибиторы A11-положительные значения1-42 олигомера также может быть изолированы от полуколичественного экспериментальные результаты.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из наиболее важных нейродегенеративных заболеваний, затрагивающих пожилых людей во всем мире1. Широко признается, что аномальные агрегации β-амилоида (значения) может быть ведущим фактором патологических AD. Aβ агрегаты являются основными компонентами старческое бляшек, один из биологических маркеров в мозгах пациентов AD. Кроме того статистические значения, в частности олигомеров, производят мощный нейротоксичности, который может быть причиной гибели нейронов как AD прогрессирует. Таким образом, ингибирование значения олигомера формирования может предотвратить нейродегенеративные, и значения олигомера ингибиторы могут быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Многие исследования использовали синтетический пептид значения образуют олигомеров в пробирке, изучения морфологии и структур искусственных значения олигомеров и расследовать ингибиторов Aβ олигомера с помощью в vitro модели2,3 , 4. Однако, различные в vitro формирование протоколов олигомера значения может привести к олигомера с различных морфологических характеристик, которые могут привести к несравненный результаты среди различных исследовательских групп. Таким образом срочно необходима стандартная формирования протокола для значения олигомера.
До сих пор не так много методов поступили непосредственно обнаружить значения олигомеров. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА), -Денатурирующий гель-электрофорез, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) и точка промокательной анализ может использоваться для изучения объема и/или морфология Aβ олигомера в vitro5, 6. Например, морфологии и структуре значения олигомера может наблюдаться в ТЕА. Относительные количества и молекулярного размера значения агрегатов может быть измерено-Денатурирующий гель-электрофорез. ELISA может использоваться для определения значения олигомера в сыворотке, плазме и выдержки из ткани мозга. И наконец точка промокательной анализ, метод, используемый для выявления, анализа и идентификации белков, могут использоваться для оценки относительной концентрации Aβ олигомера в различных образцах с помощью олигомер значения зависимости и антител. Кроме того точка промокательной пробирного предлагает значительную экономию времени, как электрофорез геля и blotting процедуры гели не требуются. Таким образом этот assay обычно используется для экрана потенциальные значения олигомера ингибиторов. Общая цель настоящего Протокола заключается в описания метода сравнительно простых, надежных и воспроизводимых подготовить пример олигомер богатые значения1-42 , проанализировать количество значения1-42 олигомера точка промокательной анализа и экран значения олигомер Ингибиторы с помощью полуколичественного экспериментальные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы сообщали метод подготовить образцы, содержащие значения1-42 олигомера и для анализа количества A11-положительные значения1-42 олигомера с точкой промокательной анализа. Хотя наши методы для подготовки значения1-42 олигомер богатые образцы являются дов?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана субсидий из национального естественных наук фонд Китая (U1503223, 81673407, 21475131), применяется исследовательский проект на некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C 37110), Нинбо международной науки и технологии Проект сотрудничества (2014D 10019), Нинбо муниципальных Инновации команда жизни науки и здравоохранения (2015C 110026), Нинбо Sci & Tech проекта для общего благосостояния (2017C 50042), Li Dak сумма ИП Чин Yio Кеннет ли морской Фонд развития биофармацевтической, и Magna Вонг C. K. Фонд университета Нинбо.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
Referências
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Bioquímica. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
