전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

대뇌 피 질의 GABAergic 수 (INs)는 그들의 생 화 확 적인 속성, 생리 적인 속성과 연결에 관해서는 다양 한 그리고 그들은 성숙 네트워크^{1,2,3 에에서 다른 기능을 중재 ,45}. 대뇌 피 질의 기능의 다른 하위 사양 광범위 하 게 공부^1,2되었습니다 유전 계곡을 통해 밀접 하 게 통제 된다. 대뇌 피 질의 GABAergic 기능의 대부분 (70%) 중간 절 예 (MGE) ventrally 위치 미 발달 구조에서에서 창시자에서 발생 하 고 외피 격판덮개^1, 에 도달 비교적 긴 거리에 걸쳐 마이그레이션 해야 합니다. ^{2 , 6}. 대뇌 피 질의 각 추 모양 세포 (VZ) 심 실 지역에서 광선으로 마이그레이션할 따라 방사형 명과 비 계 외피 격판덮개, 같은 비 계에 연결 되지 않습니다, 기능의 접선 이동 합니다 다양 한 내장과 비 대뇌 피 질의 구조^2,7,8에서 그들을 지도 하는 동안 대뇌 피 질의 판으로 마이그레이션 신경 유치의 외부 단서 세포 주기 후, 기능 화학 불쾌 신호 트리거 외피 격판덮개^9,10으로 접선 마이그레이션 MGE VZ 내 표현으로 MGE에서 격퇴는. 마이그레이션 기능 방지 다른 불쾌 신호¹¹ 의 도움으로가 고, 외피 격판덮개에 도달, 그들은 접선에서 방사형 마이그레이션 모드로 전환 피라미드에서 신호에 응답 부분에서 그들의 마지막 층 류 위치에 도달 셀¹² 그리고 다른 세포 인구¹³. 다른 신경 인구에 관해서는, 기능의 마이그레이션 신경의 실제 움직임을 허용 하도록 다양 한 동적 형태학 상 변화를 포함 한다. 이 소위 신경 운동 3 연속 단계 반복 주기 특징 이다: 주요 과정, 핵 (nucleokinesis)의 활성 참가자 움직임과 후행 프로세스¹⁴의 철회의 신장. 마이그레이션에를 개장 하는 분기 및 활성 방향 및 마이그레이션^{14,15의 속도 결정 올바른 방향으로 기능을 안내 하는 최고의 과정의 수많은 기본 및 외부 신호에 의해 통제 된다 ,16}.

최근 몇 년 동안^{1,2,7,17,18,,1920}, 마이그레이션에 대뇌 피 질의 규제 결정 광범위 하 게 연구 그리고 이러한 분자 배우의 일부 장애 neurodevelopmental 장애, 소아 내 화 간 질 또는 자폐증 스펙트럼 장애^1,2,21, 등으로 이어질 postulated 되었습니다. ^{22 , 23 , 24}. 따라서, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 방법의 개발은 이전 검토²⁵이 동적 과정을 공부 하는 우리의 능력을 크게 추구 되었습니다. 생체 외에서 포함 하 여 방법 Boyden 챔버 분석 결과 스트라이프 선택 분석 결과 신경 마이그레이션 중 요구 사항 및 특정 유전자 또는 단백질의 세포 자치 영향 평가의 빠르고 가장 재생 가능한 수단을 제공 없이 다른 요인²⁵의 영향. 이 분석 실험은 라이브 이미징^8,,2627와 결합 될 때 특히 유용 합니다. 이러한 기술로 쉽게 e13.5 MGE에서에서 검색 기능과 같이 이전^{8,28 후 다른 신호 경로 지도 단서 조사 수 있다, 효소 그리고 기계적인 분리 하 여 격리} . 그러나,이 분석 실험은 3 차원 조직 아키텍처, 잠재적으로 셀 이동 또는 생존²⁵에 영향을 미치는 신경 행동 및 셀 속성을 변경할 수 없을 경우에는 인공 기질에서 일어난다. 이러한 한계를 회피, ex vivo MGE explants 계량 동적 형태학 변화 속도 방향^{14, 같은 매개 변수와 함께 마이그레이션 중 발생 하는 대체 도구로 개발 되었습니다. 29}. MGE explants 생성은 비교적 간단 하 고 광범위 하 게 되었습니다³⁰설명 되어. 그것은 비록 후자는 선택적³¹matrigel과 콜라겐 매력 또는 반발 신호²⁵, 존재의 혼합물 또는 혼합된 대뇌 피 질의 세포의 단층에 MGE의 작은 추출의 도금을 수반. MGE explants 고해상도 띄엄띄엄 레이블이 지정 된 셀의 이미징, 세포내 프로세스, 분기, 주요 과정 cytoskeletal 개장 같이 이전^{32,33 등의 연구를 단순화에 대 한 허용 34} 및 현재 연구에서. MGE explants 성공적으로 (참조, 예를 들어 Tielens 외. 2016³³) 예를 들어 특정 약리 또는 혈 조작 후 2D 환경에서 마이그레이션에서 동안 동적 cytoskeletal 변화를 평가 하는 데 사용 되었습니다. . 그러나,이 방식으로 인공 매트릭스 내 마이그레이션 기능 그리고이 재현성 및 실험 결과의 의미와 동작 변경할 수 있습니다.

대조적으로, electroporation utero에서 그들의 네이티브 환경에서의 유전자 조작 가능 하 게 그리고 신속 하 고 효율적으로 유전자 기능의 손실과 이득의 영향의 한계를 우회 하는 동안 평가에 널리 사용 되는 방법 비용과 시간이 많이 걸리는 녹아웃 그리고 노크에서 전략^25,35. Electroporation utero에서 수 수 편견으로 창시자에 셀 유형 특정 발기인을 사용 하 여와 MGE³⁶를 포함 하 여 ventromedial 구조 쪽으로 전극을 배치 하 여. 또한, utero에서 electroporation 허용 1-2 일 이내 실험적인 구문의 적시 식 구조 식을 사용 하 여 바이러스에 필요한 7-10 일에 비해 벡터²⁵스 그러나 utero에서 electroporation의 창시자에 낮 열매를 산출 하 경향이 있다. 실제로, 지 심 실 지역에 위치한 피라미드 셀 창시자를 효율적으로 페 수 있지만 utero에서 를 사용 하 여 electroporation, MGE, 같은 더 ventrally 위치 구조를 대상으로 더 기술적으로 도전적인, 작은 e13.5에서 특히 배아 및 배아 치 더 높은 속도 실험 수익률²⁵을 감소 시킨다.

생체 외에서 와 관련 된 기술적 제한 중 일부를 회피 MGE explant 실험 및 electroporation utero에서 vivo에서 , organotypic 슬라이스 문화 비보 전 개발된^{8,37, 38,39}. 뇌 organotypic 슬라이스 문화 제공, vivo에서 흉내 낸의 이용 조건, 저렴 하 고 보다 생성 동물 모델²⁵시간이 되는 동안. 사실, 이러한 준비 기능, 특정 시각화 함께 MGE에 쉽게 액세스할 수 있도록 하 고 더 생리 환경⁸ 마이그레이션 기능에 특정 분자 경로 조사 하기 위해 초점 electroporation 결합 될 수 있다 ^{, 39 , 40 , 41}. 우리 따라서 organotypic 문화³⁸, 우리 전 utero electroporation와 시간 경과 confocal 영상 결합에 대 한 접근을 최적화는, 추가 발생 하는 형태학 및 동적 프로세스 평가 동안 MGE INs의 접선 마이그레이션. 현재 프로토콜은 적응 하 고 다른 공부 피라미드 세포^42,43 의 마이그레이션 전 utero 또는 utero에서 두뇌 electroporation 그리고 organotypic 슬라이스 문화 사용 최적화 및 대뇌 피 질의 기능^36,,3944. 특히, 마우스 배아는 참 하 고는 MGE는 electroporated ex vivo 실험 플라스 미드의 intraventricular 주입 후 보다 효율적이 고 정확 하 게 달성 될 수 있다 무엇 보다 MGE 창시자의 타겟팅 electroporation utero에서 . 두뇌는 다음 추출 하 고 몇 일 동안 경작 될 수 있다 뇌 코로나 조각으로 sectioned, 연속 되므로 추적 transfected 기능 이미징. 이 방법은 일반적으로 레이블 뇌 조각 당 5-20 tangentially 마이그레이션 기능을 실험 반복 동안 라벨의 쉽게 분리 되도록 충분히 스파스 신경 인구 통계적 의미에 도달 하는 데 필요한 수를 최소화 재건 및 미세 형태학 평가 하는 개별 신경 또한, organotypic 문화는 마이그레이션 확인 MGE explants에 비해 기능 로컬로 분 비 발산 및 thalamic afferents에서 입력을 포함 하 여 더 많은 자연 환경에 노출 됩니다. 이 접근은 이렇게 방향 및 주요 프로세스 분기 등 미세한 동적 프로세스의 특성을 허용 하도록 충분 한 해 부 세부 정보를 제공 하면서 transfected 기능 채택한 철새 경로 계량에 적합 nucleokinesis 및 후행 프로세스 철회입니다.