Поднимающей Auris Лонг Подготовка для изучения млекопитающих нервно-мышечной передачи условиях напряжение зажим
Summary
Протокол, описанных в данном документе использует мыши поднимающей auris Лонг (Лал) мышц для записи Спонтанная и вызывали нерва постсинаптических потенциалов (ток зажим) и токов (мембраной) на стыке нервно. Использование этой техники может обеспечить понимание ключевых механизмы синаптической передачи в условиях нормальных и болезни.
Abstract
Этот протокол описывает метод для записи синаптической передачи от перекрестка нервно условиях ток зажим и напряжения зажим. Ex vivo подготовка поднимающей auris Лонг (Лал) используется, потому что это тонкая мышца, которая обеспечивает простой визуализации перекрестка нервно шампур микроэлектродные на мотор концевую. Этот метод позволяет для записи спонтанное миниатюрный концевой потенциалов и токов (mEPPs и mEPCs), вызывали нерва концевую потенциалов и токов (ЭПТ и ПЭК), а также свойства мембраны мотор концевую. Результаты, полученные из этого метода включают квантовый контент (QC), количество пузырьков релиз сайтов (n), вероятность везикул релиз (prel), синаптического облегчения и депрессии, а также постоянная времени мышечные мембраны (τ m) и входное сопротивление. Применение этого метода для мыши модели болезней человека можно выделить основных патологий в положениях заболеванием и помочь определить стратегии Роман лечения. От полного напряжения зажима один СИНАПС, этот метод обеспечивает один из наиболее подробный анализ синаптической передачи имеющихся в настоящее время.
Introduction
Изучая синаптической передачи на стыке нервно обеспечивает понимание динамической взаимосвязи между нервной и скелетной мышечной систем и является прекрасной моделью для изучения синаптических физиологии. Поднимающей auris Лонг (Лал) является тонкой мышцы, позволяя для нервно соединения легко визуализировать. Предыдущие доклады описал удобство использования Лал для изучения синаптических наркотиков и токсинов и характеризуются скелетных мышечных волокон типа характеристики Лал1,2. Многочисленные исследования использовали Лал для изучения нервно-мышечной физиологии3,4,5,6,,78. Электрофизиологии способность легко наблюдать Лал нервно развязок позволяет для точного размещения микроэлектродов на мотор концевую и значительно уменьшает проблемы зажим пространство в записи синаптической передачи. Ток зажим записи мышечные мембраны свойств, таких как постоянная времени мембраны (τм) и входное сопротивление (Rв) легко получаются. Кроме того эти свойства могут быть измерены от же мышечных волокон, используемых для записи нервно-мышечной передачи, что позволяет для прямого сравнения синаптических функции для свойства мембраны мышц. Анализ этих данных может обеспечить понимание ключевых физические механизмы многих государств изменения активности и нервно-мышечных заболеваний.
Ключевым аспектом метода, описанного здесь является использование напряжения зажим для синаптических записей, которые не подлежат нелинейностей, встречающихся в ток зажим и не зависят от свойств мембраны мышц. Преимущества использования напряжения зажим в отличие от тока зажим для изучения нервно-мышечной передачи были созданы новаторские усилия в 1950-х9. Под ток зажим ЭПТ, которые превышают 10-15 МВ в амплитуде являются не линейный продукт МОСТП амплитуды9. Например, если средняя МОСТП 1 МВ, EPP 5 МВ может считаться продукта 5 mEPPs (КК 5); тогда, как EPP 40 мВ будет продуктом более чем 40 mEPPs. Это нелинейность в больших ЭПТ происходит потому, что движущей силой для Европейской народной партии, которая является разница между мембранный потенциал и потенциал равновесия для ацетилхолиновый рецептор (~ -10 МВ), существенно уменьшается во время больших ЭПТ. Эта проблема избегается в экспериментах мембраной потому, что мышцы мембранный потенциал не меняется во время экспериментов мембраной. Недостатком является, что напряжения зажим эксперименты технически сложнее, чем ток зажим записи. Имея это в виду McLachlan и Мартин разработал простой математической исправление, которое приходится нелинейностей в ток зажим записи ЭПТ10. Исправления хорошо работают11,12,13, но главное, предположим, что свойства мембраны мышцы не нарушена.
Свойства мембраны мышцы особенно важно учитывать при изучении условий или заболеваний государств, которые нарушают мышцы. Например скелетных мышц от R6/2 трансгенные модели болезнь Хантингтона является hyperexcitable из-за постепенного сокращения в отдыхая хлорид и калия токи14,15. Как следствие mEPPs и ЭПТ усиливаются в скелетных мышцах R6/2. Конечно можно изменить дополнительные факторы mEPPs и ЭПТ. Работа с другой модели мышей болезни Гентингтона (R6/1) обнаружил изменения в ЭПТ, которые, казалось, быть связаны с ЛОВУШКОЙ белки8. Для оценки механизмов, вызывающих измененное нейромышечную передачу, было бы полезным для ликвидации последствий свойства мембраны измененных мышц с помощью мембраной. В недавнем исследовании нервно-мышечной передачи R6/2 было исследовано обоих условиях ток и напряжение зажим, используя метод, описанный здесь. Совокупность мотор endplates были напряжения зажимается с менее чем 1% ошибок, поставив два микроэлектродов в рамках постоянной длины концевую16. Это было показано что мембраной и исправления записи ток зажим, приносят контрастные измерения нервно-мышечной передачи в R6/2 мышц. Это подчеркивает, что это может быть трудно исправить ЭПТ для нелинейностей, если были изменены свойства мембраны мышц и показывает преимущества получения мембраной записей, которые не зависят от свойств мембраны мышц. Протокол, представленные здесь идеально подходит для изучения условий или болезненных состояний, которые влияют на свойства постсинаптической мембраны и синаптической передачи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь является подготовка и использование мыши Лал мышц для измерения нервно-мышечной передачи зажим тока или напряжения условиях. Есть несколько важных моментов, чтобы рассмотреть для рассечения, Лал. Очистки излишки соединительной ткани от СПИДа мышц в электрод шампур, ка?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Марк м. богатые и Даниэль Миранда за редакционные комментарии, Ахмад Khedraki за помощь в создании этой техники и Райт государственный университет для финансовой поддержки (запуска фонд A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referências
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurociência. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurociência. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
