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Biologia

Verwendung von Anti-Phospho-girdin Antikörper gegen Darm Büschel Zellen frei schwebenden Maus Jejunum Cryosections visualisieren

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/57475
, , , , , , ,
1Division of Perinatology, Institute for Developmental Research,Aichi Human Service Center, 2Surgery Department,Anjo Kosei Hospital, 3Department of Pathology,Nagoya University Graduate School of Medicine

Summary

Kuga Et Al. entdeckt, dass Phosphorylierung-Status spezifische Antikörper gegen die Aktin bindende Protein girdin phosphoryliert an Tyrosin 1798 (pY1798) verwendet werden können, um Büschel Zellen (TCs) zu bezeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht robuste Visualisierung von TCs mit immunofluorescent Färbung des frei schwebenden Jejunum Cryosections mit pY1798 Antikörpern.

Abstract

Aktin bindende Protein girdin ist eine cytosolische Protein, das für Aktin Umbau zum Zellwanderung in verschiedenen Geweben auslösen benötigt. Girdin ist von nicht-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen an Tyrosin 1798 und Rezeptor phosphoryliert. Omori Et Al. entwickelt Website und Phosphorylierung Status-spezifische Antikörper gegen menschliche girdin an Tyrosin-1798 (pY1798), die spezifisch phosphorylierten Tyrosin-1798, aber nicht unphosphorylated Tyrosin-1798 binden. pY1798 Antikörper wurden verwendet, um speziell Büschel Zellen (TCs) kennzeichnen, die in Säugetieren Magen-Darm-Gewebe vorhanden sind, aber die Funktion dieser Zellen ist unklar. Dieses Protokoll ermöglicht die robuste Visualisierung des TCs in das Jejunum mit pY1798 Antikörpern und Immunfluoreszenz. Um erfolgreich und einfach TC Visualisierung zu gewährleisten, enthält dieses Protokoll zwei histologische Techniken: Produktion des frei schwebenden Cryosections aus Gelatine gefüllten Jejunum Gewebe und Niedertemperatur-Antigen-Retrieval bei 50 ° C für 3 h das Jejunum mit Füllung Gelatine behält die Form der frei schwebenden Abschnitte im gesamten Färbeverfahren, während Niedertemperatur-Antigen-Retrieval erfolgreichen Einsatz des Protokolls führt zu pY1798 Färbung des TCs verteilt von Villus Spitze, dafür sorgt, dass robuste Signale von TCs. Krypta. Gefärbten TCs haben eine Spule-förmigen Soma und fluoreszierende Signale verdichten an der lumenal Spitze, das entspricht die hervorstehenden “Büschel”. Phalloidin Färbung colocalized mit pY1798-positiven TCs an der verdickten Pinsel-Grenze, und entspricht einer Darre Masse erstreckt sich von der TC-Büschel. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um TCs in menschlichen Biopsie Proben mit Magen-Darm-Endoskopen untersuchen. Darüber hinaus wurden TCs kürzlich berichtet akkumulieren nach Parasitenbefall bei Mäusen, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll Anwendungen für die Diagnose von Infektionen Parasiten in den menschlichen Darm haben könnte.

Introduction

Büschel Zellen (TCs) sind kleinere verstreuten Bestandteile des Magen-Darm-Epithelien, die gekennzeichnet sind durch apikalen Büschel und Spool-förmigen Somas1. Obwohl TCs erstmals 19562beschrieben wurden, bleibt TC Funktion unklar, teils aufgrund mangelnder zuverlässige TC Marker.

Enomoto Et al. zunächst zeichnet sich die Aktin-Bindeprotein, girdin3, die im Nervensystem, sowie in nicht-neuronale Gewebe z. B. Herzklappen, Blutgefäße, Sehnen und Skelettmuskulatur4zum Ausdruck kommt. Mäuse mit genetischen Ablation von girdin zeigen verlangsamtes Wachstum und mehrere Gehirn Anomalien4,5,6. Unterdessen ist der Verlustfunktion Mutation im menschlichen girdin progressive Enzephalopathie, schwere Retardierung und frühen Beginn epileptische Anfälle7zugeordnet.

Im Jahr 2011 identifiziert Lin Et Al. dynamische Phosphorylierung des girdin an Tyrosin 1798 durch Tyrosin-Kinasen wie EGFR und Src8vermittelt. Sie zeigten auch, dass phosphorylierten girdin für Aktin Umbau zum Auslösen von Zelle Migration8benötigt. Omori Et Al. entwickelte Website – und Phosphorylierung Status-spezifische Antikörper gegen menschliche girdin an Tyrosin 1798 (pY1798 Antikörper) nach Gotos-Protokolls phosphoryliert und validiert die Antikörper mit Site-verwiesene Mutagenese der Ausdruck Vektoren tragen in voller Länge girdin9,10. Im Jahr 2017, Kuga Et al. berichtet, dass pY1798 TCs mit hoher Spezifität und hohe Empfindlichkeit1Etiketten. Die pY1798 Antikörper erwiesen sich gegenüber vorherigen TC Marker basierend auf ausgezeichnete befleckenden Eigenschaften, die der ganze Zelle Form, darunter das Merkmal “Büschel” auf der lumenal Spitze, noch die biologische Rolle von girdin aufgedeckt und Phospho-girdin im TC Funktion blieb unklar1.

In dieser Studie beschriebene Methode beinhaltet Immunfluoreszenz-Färbung, eine histologische Technik, um ein bestimmtes Protein auf das Gewebe mit einer primären Antikörper gegen ein Zielprotein und Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper gegen die primäre markieren Antikörper. Der Zweck dieser Methode ist es, Forscher mit begrenzter histologischen Erfahrung TC Bilder in hoher Qualität zu ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet frei schwebenden Cryosections, die zu vermeiden die Notwendigkeit einer Folie montiert Cryosections oder paraffin Abschnitt. Jedoch frei schwebenden Abschnitte sind zerbrechlich wegen fehlender Unterstützung durch einen Objektträger und Schnittdicke Antikörper Permeabilität verringern kann. Dieses Protokoll enthält zwei Ansätze, die diese Probleme zu überwinden: (1) füllen das gesamte Jejunum Lumen mit Gelatine, die Morphologie des frei schwebenden Abschnitte der befleckenden Verfahren zu erhalten und (2) die Nutzung von Niedertemperatur-Antigen-Retrieval, pY1798 Signale zu verstärken.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die Animal Care and Use Committee am Institut für Entwicklungsforschung, Aichi Human Service Center genehmigt (Aktenzeichen: M-03). 1. Vorbereitungen 10 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten: 32,27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80,0 g NaCl zu Reinstwasser zu einem Endvolumen von 10 L. Store-Lösung bei Raumtemperatur (RT) hinzugefügt. Bereiten Sie 200 mL PBS-T: 200 mL PBS aus Schritt 1.1 mit 100 µL polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether, eine Endkonzentration von 0,05 % (Vol:vol). Shop bei RT Beim Tragen von Handschuhen und Schutzbrille, bereiten Sie 50 mL 15 % Saccharose in 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung: 7,5 g Saccharose hinzugefügt, um 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung (Table of Materials) zu einem Endvolumen von 50 mL. Shop bei RTAchtung: Einatmen und/oder Haut/Augen Kontakt mit Formaldehyd in 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung kann gefährlich sein. Mit Vorsicht handhaben. 1,5 mL 200 Einheiten/mL Phalloidin-fluoreszierenden Farbstoff conjugate Stammlösung vorbereiten: Phalloidin-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert (300 Einheiten in 1 Durchstechflasche, lyophilisierter Feststoffe, Anregung und Emission Wellenlängen: 581 nm und 609 nm, beziehungsweise) suspendiert in 1,5 mL Methanol. Shop-Lösung im Dunkeln bei-20 ° C. Bereiten Sie 5 mg / mL 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Lösung auf Lager: 10 mg DAPI in 2 mL N, N-Dimethylformamid (DMF). Shop-Lösung im Dunkeln bei-20 ° C. 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS vorbereiten: 0,5 g der BSA, 10 mL PBS. Shop bei 4 ° C. Entfernen Sie die abgeschrägte Spitze von einer gerade 18-Gauge-Nadel mit einem Nipper, und Kneifen Sie betonter Ende mit einem Pincher in Längsrichtung, Flüssigkeit durch die Nadel Lumen (Abbildung 1A1) fließen zu lassen.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. (2) Tier sezieren und Isolierung von Jejunum Perfusion Fixierung einer Maus Tragen Sie Handschuhe und arbeiten in einem gut belüfteten Raum. Bereiten Sie einen 100-mL-Becherglas, 10 % gepuffert, neutrale Formalin-Lösung, chirurgische Instrumente (Schere, Pinzette), einer metallischen Fach, 6-0 Nylon schneiden Nähte, eine gerade 18-Gauge-Nadel vorbereitet wie in 1.7, eine geflügelte 22-Gauge-Nadel, eine 20-mL-Spritze. Laden Sie 20 mL 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung aus dem Becherglas in der 20-mL-Spritze, und befestigen Sie die geflügelte 22-Gauge-Nadel an die Steckdose. Bereiten Sie flüssige Gelatine durch Zugabe von 1 g Gelatine-Pulver, 20 mL PBS (letzte 5 % Gelatine) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen vor. Nach dem Einweichen für 15 min bei RT inkubieren Sie bei 50 ° C in einem Wasserbad für 15 min ohne schütteln. Kurz Wirbel und inkubieren Sie bei 50 ° C für weitere 15 min bis die Gelatine vollständig auflösen. Lassen Sie das Rohr bei RT bis zur Verwendung. Einschläfern Sie Erwachsenen Mäuse durch zervikale Dislokation. Platzieren Sie den Mauszeiger aus Schritt 2.1.6 auf einem metallischen Tablett und machen Sie einen kleinen Schnitt auf der Haut durch den Schwertfortsatz Knorpel mit chirurgischen Werkzeugen. Erweitern Sie den Schnitt mit beiden Händen an die thorakalen und abdominalen Regionen verfügbar zu machen. Öffnen Sie das Bauchfell, die das Zwerchfell aussetzen und dann die Membran auf beiden Seiten. Schneiden Sie den Brustkorb entlang der vorderen axillären Linien auf beiden Seiten, dann entfernen Sie der Thoraxwand durch Schneiden in Querrichtung an der Position des Thymus, das Herz aussetzen. Machen Sie einen kleinen Schnitt auf die Ohrmuschel des rechten Atriums abtropfen lassen das Blut und fügen eine geflügelte 22-Gauge-Nadel in der Spitze des linken Ventrikels. Drücken Sie den Kolben, um das Gewebe mit 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung durchspülen. Schneiden Sie nach Freilegung der Organe im Becken das Ende des Mastdarms aus dem After und trennen Sie Darm aus dem Körper zu, schneiden das Mesenterium. Um das Jejunum zu isolieren, schneiden Sie den Darm 4 cm von der anal Seite des Magens Antrum. Entsorgen Sie die anale Hälfte des verbleibenden Dünndarms. Befestigen Sie das Jejunum in zwei Hälften um den Spülvorgang zu erleichtern. Last 20 mL 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung in die 20-mL-Spritze und befestigen Sie die gerade 18-Gauge-Nadel im Schritt 1,7 an der Steckdose vorbereitet. Injizieren Sie 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung von einem Ende des beschnittenen Jejunum zu spülen, den Darminhalt und die Darm Lumen Oberfläche (Abb. 1A2) zu beheben. Waschen Sie das Darm Lumen durch die Injektion von PBS, wie in Schritt 2.1.15 beschrieben. Spülen Sie flüssige Gelatine in das Lumen der Darm wie unter Schritt 2.1.15 PBS mit flüssigen Gelatine ersetzen. Nahe einem Ende des beschnittenen Jejunum durch Unterbindung der Naht mit einem 6-0-Nylon Naht schneiden, füllen Sie das Jejunum mit flüssigen Gelatine und Naht Ligatur (Abbildung 1A3) in der Nähe der Gegenseite. Fügen Sie vier Knoten der Naht einen wurstförmige Jejunum Abschnitt auf den depressiven Teil des einen Cryomold (Abbildung 1A4) angepasst.Hinweis: Für Cryomolds mit einer 20 mm x 25 mm x 5 mm deprimiert Abschnitt ist ein ~ 20 mm Wurst-ähnliche Jejunum Abschnitt vorzuziehen. Genießen Sie das Gewebe in 50 mL 15 % Saccharose in 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung über Nacht bei 4 ° C.Hinweis: Diese Schritte sicherstellen Cryoprotection von Saccharose und Protein Fixierung von Formalin von Gelatine und Gewebe. Formalin verkleistert Gelatine schmilzt nicht bei RT, während nicht fixierten verkleisterte Gelatine bei 4 ° C bei RT schmilzt 3. Rasten Sie Einfrieren von Gelatine gefüllten Jejunum Gewebe Schneiden Sie das Jejunum an der Naht Knoten, werden drei Wurst-ähnliche Jejunum Stücke mit beiden Enden ligiert (Abbildung 1A4) gewonnen. Richten Sie die Wurst-ähnliche Stücke in ein Cryomold für die Addition der Einbettung von zusammengesetzten für Vorbereitung der gefrorene Gewebeproben. Snap freeze Cryomold in Isopentane mit flüssigem Stickstoff gekühlt. Cryomolds bei-80 ° C lagernHinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. 4. Immunfluoreszenz Büschel Zellen mit frei schwebenden Cryosections Kryoschneiden Legen Sie den Kryostaten Kammertemperatur (CT) und die Objekttemperatur (OT) bis-22 ° C. Ort der gefrorenes Gewebe blockieren in einem Cryomold in der Kryostat Kammer für mindestens 15 Minuten. Ein 35-mm-Kulturschale 3 mL PBS hinzufügen. Entfernen Sie gefrorenes Gewebe-Block aus der Cryomold und schneiden Sie den Block in der Mitte mit einer Rasierklinge, der Querschnitt der Jejunum verfügbar zu machen. Montieren Sie eine Hälfte des Blocks auf ein Futter (einem Kryostat-Adapter) Abschnitt die Schnittebene mit der Rasierklinge. Abschnitt der Gelatine gefüllten Jejunum in 30 µm dicke Abschnitte. Verwendung eingefroren Zange vorsichtig in den Abschnitten in der 35-mm-Kulturschale vorbereitet im Schritt 4.1.2 (Abb. 2 bRechts) übertragen. Anwendung des primären Antikörper Waschen Sie die frei schwebenden Abschnitten in der 35-mm-Kulturschale 3 Mal für 5 min mit 3 mL PBS-T mit milden schütteln auf einem gegenseitigen Shaker (ca. 36-Mal / min). Bereiten Sie Antigen-Retrieval-Lösung: 0,3 mL Antigen Retrieval Lösung Konzentrat (Table of Materials) in 2,7 mL Reinstwasser. Der 35-mm-Kulturschale mit frei schwebenden Abschnitten fügen Sie 3 mL Antigen-Retrieval-Lösung hinzu. Schließen Sie den Deckel, versiegeln Sie die Lücke zwischen dem Gericht und den Deckel mit einem Streifen Klebeband Vinyl zu und inkubieren Sie bei 50 ° C in einer Hybridisierung Inkubator für 3 h ohne schütteln. Entfernen Sie die Schale aus dem Inkubator und für 20 min bei RT abkühlen. Waschen Sie nach dem Entfernen der Vinyl-Band, in den Abschnitten 3 Mal für jeweils 5 min mit 3 mL PBS-T und leicht schütteln. Aspirieren der PBS-T und 5 Tropfen der blockierenden Lösung (Table of Materials) auf den Abschnitten. 5 min mit milden Schütteln bei RT inkubieren. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung: 495 µL 5 % BSA in PBS mit 5 µL Phospho-Y1798 girdin (pY1798) Antikörper (Table of Materials). Fügen Sie 500 µL Primärantikörper Lösung auf die Abschnitte (die blockierende Lösung muss nicht entfernt werden). Legen Sie die Schale in eine befeuchtete Inkubation Kammer und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit milden schütteln.Hinweis: Die Übernachtung Inkubation kann auf bis zu drei Nächte verlängert werden. Anwendung der Sekundärantikörper Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 min in 3 mL PBS-t mit milden schütteln. Bereiten Sie verdünnte DAPI-Stammlösung: 2 µL der Stammlösung DAPI (Schritt 1.5), 998 µL PBS. Sekundärantikörper Lösung: 476 µL 5 % BSA in PBS, 10,5 µL Lösung verdünnt DAPI, 12,5 µL Phalloidin-fluoreszierenden Farbstoff conjugate Stammlösung, 1 µL Ziege Anti-Kaninchen IgG-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert (Wellenlänge: Erregung 496 nm, Emission 520 nm). Nach dem Absaugen der PBS-T, wenden Sie die sekundäre Antikörper-Lösung und brüten in einer Kammer Licht abgeschirmt Inkubation bei RT für 30 min mit milden schütteln. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 min mit 3 mL PBS-T und leicht schütteln. Nach dem letzten Waschen die PBS-T entfernen und ersetzen mit 3 mL PBS fehlt polyoxyethylene(10) Octylphenyl Äther. Übertragen Sie das Gericht auf eine stereoskopische Mikroskop. Platz 200 µL PBS in ein Tröpfchen in der Mitte des MAS-beschichtete Weißglas Rutsche und Übertragung einer Jejunum Abschnitt aus der Schale in den Tropfen mit einer P200 Pipettieren Spitze. Aspirieren Sie nach der Einstellung der Ausrichtung unter dem stereoskopische Mikroskop alle verbleibenden PBS rund um den Abschnitt. 20 µL der wässrigen Montage Medien hinzufügen und ein 20 x 20 mm-Deckglas auf den Medien zu platzieren. Versiegeln Sie die Deckglas Schnittflächen mit Xylol-basierte Montage Medien sofort. Legen Sie die Folie auf einem hölzernen Mappe und lassen Sie die Xylol-basierte Montage-Medien, für 2-3 h bei RT zu festigen.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Nach der Montage Xylol-basierte Medien erstarrt, können die Folien für 2-3 Wochen in einer Licht abgeschirmt Folie Box bei RT gespeichert werden 5. der konfokalen Mikroskopie 63 X Objektiv von einem confocal Mikroskop Immersionsöl aufsetzen. Drehen Sie die Deckglas-Folie nach unten und legen Sie die Folie auf der Bühne. Digitalisieren Sie die TC-Bilder erworben bei Laser Wellenlänge 405, 488 und 555 nm und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format (TIFF).Hinweis: Wählen Sie eine Erkennung Filter, die für die Fluoreszenz-Farbstoffe geeignet ist (z.B. Anregung/Emission Maxima: 358/461 nm, 490/525 und 590/617).

Representative Results

Gelatine-Füllung das jejunum Eine typische Vorgehensweise zum Füllen von Maus Jejunum mit Gelatine ist (Abbildung 1A), gezeigt, wie die Vorteile der Gelatine-Füllung (Abbildung 1 b) sind. In Kürze wurde die abgeschrägte Spitze von einer gerade 18-Gauge-Nadel entfernt, um Schutz gegen die Darmwand (Abbildung 1A1) piercing. Gelatine-Füllung wurde erreicht mit 10 % gepuffert neutral Formalin-Lösung injiziert, von einem Ende des einen beschnittenen Jejunum Abschnitt, den Darm zu leeren und die Darm Lumen Oberfläche (Abb. 1A2) beheben vor dem Befüllen mit flüssigen Gelatine ( ) Abbildung 1A3). Die daraus resultierende Wurst-ähnliche Stücke (Abbildung 1A4) eingebettet, eingefroren und quer geschnitten in 30 µm dicken Scheiben in einem Kryostaten. In Abwesenheit von Gelatine Füllung tendenziell Jejunal Abschnitte Knick, so dass die Zotten nach hinten schwingen (Abbildung 1 bLinks). Gelatine-Füllung bewahrt die Runde Scheibenform der Abschnitte und unterhält, aufrechte Positionierung der Zotten (Abbildung 1 bRechts). Die Bilder zeigen deutlich die Vorteile durch die Gelatine, die Erhaltung der Morphologie des frei schwebenden Jejunum Abschnitte ausfüllen. Erfolgreiche Bildgebung der intestinalen Büschel Zellen pY1798 Antikörper können für Variable Immunostaining Techniken, einschließlich Dot Blot, westliche Beflecken, Paraffin Abschnitt beflecken, Tauwetter montierte Cryosection beflecken oder frei schwebenden Cryosection1,9Färbung angewendet werden. In diesem Protokoll konzentrierten wir uns auf frei schwebenden Cryosections für Fluoreszenz Färbung des TCs in Maus Jejunum mit pY1798 Antikörpern, Phalloidin und DAPI-Färbung um die strukturellen Merkmale der TCs1zu demonstrieren. TCs sind in der Regel mit einer Rate von ungefähr einem TC/100 Epithelzellen von Villus Spitze Krypta1verteilt. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass dieser pY1798 umreißt reproduzierbar gesamte TCs, einschließlich der Membran, Zytoplasma der Spool-förmigen Soma und den stark verschmutzten lumenal Tipp, wo Kondensation robustes Signal entspricht die hervorstehenden “Büschel” WP1 ()Figur 2A-2 b). Unterdessen Phalloidin ist eine Phallotoxin, eine Familie von giftigen bicyclischen Heptapeptides aus dem Pilz Amanita Phalloides, und hat hohe Affinität für filamentösen Aktin (F-Actin), die in Mikrovilli, die die intestinale Bürste Grenze bilden vorhanden ist 11. Phalloidin reproduzierbar und deutlich markiert die verdickten Pinsel-Grenze, die eine Masse von Würzelchen erstreckt sich von der Büschel-1entspricht. So zeigt die konsistente Co Lokalisierung von pY1798 Signalen (Spool-förmigen Soma, Signal Kondensation an der lumenal Spitze) mit dem prominent verdickte Phalloidin-Positive Bürste Rand, dass dieses Protokoll erfolgreich TCs unabhängig von identifiziert ob sie auf einem Villus ()Abbildung 2A( ) oder in einer Krypta ()Abbildung 2 b() befinden. Niedertemperatur-Antigen-Retrieval ist effektiv für die Färbung frei schwebenden Abschnitte Hitze-basierte Antigen-Retrieval bei 95-99 ° C ist für die Analyse von Paraffin Abschnitte und Folie montiert Cryosections verbreitet. Anwendung dieses Ansatzes zur frei schwebenden Abschnitte ohne Schäden zu verursachen ist jedoch schwierig, weil solche Abschnitte sind in der Regel empfindlicher als Folie montiert Abschnitte, die durch die Folie12unterstützt werden. Seit Niedertemperatur-Antigen-Retrieval (50 ° C für 3 h) mit einem Wasserbad hatte keinen Einfluss auf die Morphologie der frei schwebenden Jejunum Abschnitte in Vorversuchen, wir bewerten die objektiven Wirksamkeit der Antigen-Retrieval in einem Blind zu testen, die statistisch bestätigt die Wirksamkeit von Niedertemperatur-Antigen-Retrieval ()Abbildung 3(). Abbildung 1: Gelatine Füllung Jejunum Abschnitte für morphologische Erhaltung der cryosections(A) Fotos von Verfahren für Intraluminal Füllung der Maus Jejunum mit Gelatine. (A1) Die abgeschrägte Spitze von einer gerade 18-Gauge-Nadel wurde entfernt, um zu vermeiden, die Darmwand piercing. (A2) Neutral gepuffertem Formalin-Lösung (10 %) injiziert wurde, in das eine Ende des beschnittenen Jejunum, spülen Sie den Darminhalt und Darm Lumen Oberfläche zu beheben. (A3) Abgeschnittene Jejunum gefüllt mit flüssigen Gelatine und an beiden Enden ligiert mit einem 6-0 Nylon Naht (schwarze Pfeile). (A4) Vier weitere Naht Knoten (weisse Pfeile) platziert zwischen den bereits bestehenden Naht Knoten (schwarze Pfeile) ergab drei kürzere Stücke. Das Gewebe wird dann in drei Wurst-ähnliche Stücke auf die beiden angegebenen Positionen (weiße Pfeilspitzen)getrennt werden. (B) wohltuende Wirkung von Gelatine-Füllung auf frei schwebenden Cryosection Morphologie. Ohne Gelatine Füllung tendenziell Abschnitte Knicken, so dass die Zotten, leicht nach hinten (links)zu schwingen; mit Gelatine Füllung, einen 30 µm dicken Abschnitt unterhält eine Scheibenform und die aufrechte Position der Zotten ist erhalten (rechts). Bilder wurden fotografiert mit Nomarski differential Interferenz Kontrast. Skalieren Sie Bars, 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Repräsentative Fluoreszenzbilder von Mauszellen Darm BüschelKonfokale Fluoreszenzbilder der TCs auf eine Villus (A) oder in einer Krypta (B), Jejunum abschnittsweise frei schwebenden Maus mit ortsspezifischen befleckt und Phosphorylierung-Status-spezifische Antikörper gegen girdin phosphoryliert an Tyrosin 1798 ( pY1798, grün, optimale Anregung/Emission Wellenlängen 490/525 nm), Phalloidin (rot, 590/617 nm), 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, blau, 358/461 nm). Die Gegend, umgeben von weißen Kästchen in den Bildern geringer Vergrößerung (Maßstabsbalken, 50 µm) ist auf der rechten Seite (Maßstabsbalken, 10 µm) erweitert. pY1798 Antikörper Fleck reproduzierbar TCs, unabhängig von Ihrem Standort (auf einem Villus (A)oder in einer Krypta (B)), mit Flecken auf der lumenal Spitze (Pfeile), Membran und Zytoplasma der Spool-förmigen TC Soma. Eine prominent verdickte Pinsel Grenze in Phalloidin Färbung (Pfeilspitzen) ist ein weiteres Erkennungszeichen des TCs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Niedertemperatur-Antigen-Retrieval verbessert pY1798 ImmunfluoreszenzZwei Gruppen von experimentellen Verfahren wurden verglichen, um die Wirksamkeit der Niedertemperatur-Antigen-Retrieval zu bestätigen. Freischwebende Jejunum Abschnitte (30 µm dick, n = 13) aus ein gefrorenen Block wurden in zwei Gruppen eingeteilt und Abschnitte aus jeder Gruppe waren voller Flecken, die nach dem vollständigen Protokoll oder das gleiche Protokoll fehlt Niedertemperatur-Antigen-Retrieval (Schritt 4.2.2). Nach dem Färben, Abschnitte wurden auf einzelnen Folien beschriftet mit Gruppennummern montiert, und die Kennzeichnung auf jeder Folie mit Klebeband bedeckt war. Alle Folien waren gemischt, mit neuen Nummern auf dem Band beschriftet und beobachtet unter Fluoreszenzmikroskopie durch einen FITC-Filter. Insgesamt zählt der sichtbaren pY1798-positiven TCs wurden in jeder Gruppe gemittelt und wurden in ein Balkendiagramm (Mittelwert ± Standardabweichung) angezeigt. Ein zwei-tailed t-Test wurde durchgeführt, um die durchschnittliche Grafen zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. P-Werte unter 0,05 galten statistisch signifikant. Niedertemperatur-Antigen-Retrieval verbessert die Wirksamkeit der pY1798-Immunfluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Forschern ohne Histologie Erfahrung zuverlässige Aufnahmen Büschel Zellen (TCs) ermöglichen. Dieses Protokoll hat drei kritische Punkte: 1) die Nutzung der Website und Phosphorylierung Status-spezifische Kaninchen polyclonal Antikörper gegen menschliche girdin phosphoryliert an Tyrosin 1798 (pY1798 Antikörper), die gewonnen wurden, von einem bestimmten Unternehmen ( Immuno-Biological Laboratories = Firma X); (2) Gelatine Füllung das Jejunum; und 3) Niedertemperatur-Antigen-Retrieval. Im weitesten Sinne können Phosphorylierung Status-spezifische Antikörper als Modifikation-spezifische Antikörper, die eine bestimmte Art von Post-translationale Modifikation (z.B. Acetylierung, Methylierung oder Phosphorylierung) von erkennen kategorisiert werden eine Protein an eine bestimmte Aminosäure-Rückstände. Omori Et al. und X gemeinsam erwirtschaftete pY1798 Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen mit phosphorylierten Peptid, und reinigen die daraus resultierenden Antikörper mit Festphasen-Chromatographie mit ein unphosphorylated Peptid nach Gotos Methode9, 10. pY1798 Antikörper wurden intensiv mit in-vitro- Phosphorylierung Assays mit Full-length menschlichen girdin Expressionsvektoren mit/ohne eine Punktmutation an Tyrosin 17989validiert. Anschließend fand Kuga Et Al. , dass pY1798 Antikörper von Firma X spezifisch und sensitiv Marker für intestinale TCs1. So ist die Aufnahme von pY1798 Antikörpern von Firma X einen kritischen Punkt in diesem Protokoll.

Gelatine enthält Kollagen aus tierischen Geweben gewonnen und ist seit langem verwendet, Gewebeproben für histochemische Untersuchungen mit Cryosections13einzubetten. Niedriger Schmelzpunkt Gelatine, verkleistert ist bei 4 ° C, schmilzt bei Raumtemperatur jedoch fing an angewendet werden, um nachteilige Auswirkungen von Wärme benötigt um die Gelatine in einem flüssigen Zustand zu halten, während der Einbettung14zu vermeiden. In diesem Protokoll wurde niedriger Schmelzpunkt Gelatine hergestellt aus Gelatine-Pulver, die Gelierprobe bei 4 ° C und schmilzt bei RT verwendet, um die Morphologie der transversalen Cryosections der Maus Jejunum zu bewahren. Wenn diese Gelatine verwendet wurde, um das Jejunum ausfüllt, wurden Proben dann Formalin-fixiert, irreversible Gelierung zu erreichen. Hitze-induzierte Antigen-Retrieval ist eine effektive Methode, um Antigene verfügbar machen, die von Aldehyd-haltigen Fixiermittel12maskiert sind. Allerdings können die hohen Temperaturen (95-99 ° C für 30 min), allgemein verwendet für die Analyse von Paraffin Abschnitte die Morphologie der Gewebe/Gelatine komplexe beschädigen. Hier verwendeten wir Niedertemperatur-Antigen Abruf (50 ° C für 3 h), die Antigen-Retrieval und Erhaltung der Morphologie der Gewebe ermöglicht.

pY1798 Antikörper können nicht nur im Jejunum Maus, sondern auch in mehreren Organen (Magen, Ileum, Colon und Gallenblase) von Mäusen und Menschen1TCs beschriften. Jedoch da pY1798 Signale in fixierten Gewebe aus jedem Gewebe rapide verschlechtern werden, enthält dieses Protokoll Formalin Injektion in das Jejunum Lumen (Schritt 2.1.15., Abb. 1A2).

Es gibt Einschränkungen verbunden mit der Dicke der frei schwebenden Cryosections. Obwohl dünne Cryosections in Bezug auf die Transparenz für die Mikroskopie von Vorteil sein kann, macht der Schlankheit in diesen Abschnitten physisch angreifbar. Im Gegensatz dazu dick Cryosections sind körperlich robust, aber haben geringere Permeabilität der Antikörper in den Abschnitt. In diesem Protokoll 30 µm dicke Abschnitte verwendet wurden, waren körperlich stabil und für Antikörper durchlässig. Obwohl diese Methode für Forscher ohne umfangreiche Erfahrung in der Histologie, entwickelt wurde wenn das Protokoll ausfallen sollte, Abschnitte ähnlich dem von Kuga Et Al. verwendeten pY1798/Villin/DAPI dreifache Färbung des Paraffins durchgeführten1könnte sein. Paraffin-Abschnitte wurden hier nicht verwendet, Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Phalloidin Färbung des F-Aktin in Paraffin Abschnitte zu vermeiden.

Durch die Erhaltung der Aminosäuresequenzen angrenzend an Tyrosin-1798 girdin können pY1798 Antikörper um TCs in anderen Arten als Maus, einschließlich Mensch und Ratte Flecken angewendet werden. Die in diesem Protokoll verwendeten Gelatine-Füllung kann auch für andere Hohlorgane angewendet werden. In der Tat, abgesehen von pY1798 oder TC, die Kombination von Gelatine Füllung mit Niedertemperatur-Antigen-Retrieval möglicherweise hilfreich für die Aufspürung notorisch “schwierig” Epitope im Darm Maus und folglich für viele Forscher von Interesse sein kann.

Die biologische Rolle von girdin und die Bedeutung seiner Phosphorylierung in TCs ist unklar. Jedoch eine Studie von Lin Et Al. vorgeschlagen, dass Tyrosin Phosphorylierung des girdin ist verbunden mit dem Grad der F-Aktin-Polymerisation-8. Unterdessen Kuga Et Al. fanden, dass tödliche Dosen von Apoptose induzieren (zB., Cisplatin, Röntgenstrahlung) verursacht eine große Zunahme der relativen Häufigkeit des TCs im Dünndarm Maus, die sie die Hypothese zugeordnet werden kann die mögliche Umwandlung von Enterozyten TCS, in Synchronisierung mit der Phosphorylierung des girdin in Mikrovilli1. Diese Möglichkeit wird in Zukunft weitere Untersuchung erfordern. Drei Gruppen, die vor kurzem beobachtet rasante Zunahme der TC Frequenz nach Parasit Infektion15,16,17. So, diese frei schwebenden Färbung könnte verwendet werden, nicht nur um endoskopisch gesammelten menschlichen Darm Geweben zu analysieren, sondern TC Ansammlung könnte auch Hilfe bei der Diagnose einer Parasiteninfektion mit in den menschlichen Darm.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Naoya Asai an der Universität Nagoya für die Bereitstellung von nützlicher Anregungen für die Entwicklung von Niedertemperatur-Antigen-Retrieval für frei schwebenden Jejunum Abschnitte. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für Scientific Research (KAKENHI) (C) im Jahr 2012 (JP25460493) und (B) im Jahr 2017 (JP17H04065), der Japan Society für Promotion of Science (JSPS), gewährt ein Schritt im Jahr 2014 (AS251Z02522Q) und im Jahr 2015 (AS262Z00715Q) aus der Japan Science and Technology Agency (JST) sowie ein Visionär Takeda Research Grant 2014 von der Takeda Science Foundation (M.A.).

Materials

Slc:DDY 6-week-old female mice Chubu Kagaku Shizai Not applicable
Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) Wako 196-02835
Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O Wako 199-02825
Sodium chloride (NaCl) Wako 199-10665
Triton X-100,  Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether Katayama Chemical Not applicable
Sucrose Wako 190-00013
10% buffered neutral formalin solution Muto Chemical 20215 Step 1.3.
Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin ThermoFisher Scientific A12381
Methanol Nacalai Tesque 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306
N.N-dimethylformamide (DMF) Nacalai Tesque 13015-75
Bovine serum albumin Sigma A9647-10G
18-gauge stainless steel straight needle Terumo NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun Kono Seisakusho Not applicable
22-gauge winged needle Terumo SV-22DLK
20 mL TERUMO syringe Terumo SS-20ES
50 mL centrifuge tube TPP 91050
15 mL Iwaki centrifuge tubes Iwaki 2325-015
1.5 mL micro test tube Star RSV-MTT1.5
Gelatin powder, Gelare-blanc Nitta Biolab 2809
Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece Sakura FineTech 4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) Shoei Work's 1101-3
Isopentane Nacalai Tesque 26404-75
Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip Corning 353001
Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x Dako S2367 Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.
Protein Block Dako X0909 Blocking solution in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X 28143 Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11034
Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36930
Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 Matsunami Glass C022221
Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy Merck Millipore 107961
MAS-coated slide glass white Matsunami Glass MI-MAS-01
Wooden Mappe KO-type Shoei Work's 99-40007
Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml Zeiss 444960
Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) Gilson F144801, F123600, F123601, F123602
Ultrapure water production system Advantec GS-590
Plastic glove, Star Nitrile Glove Star RSU-NGVM
Cryostat Leica Microsystems CM1950
Deep freezer, SANYO Ultra Low Sanyo MDF-382
Showcase refrigerator Nihon Freezer NC-ME50EC
Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) Taitec 0068750-000
Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) Taitec HB-100
Incubation chamber for immunostaining Cosmo Bio 10DO
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) Taitec NR-1
Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) Tokyo Rika Kikai MMS-3010
Stereoscopic microscope (for tissue handling) Olympus SZ61
Stereoscopic microscope (for Figure 1B) Leica Microsystems M165FC
Fluorescence microscope (for Figure 3) Nikon E800
Confocal laser-scanning microscope Zeiss LSM700
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Referências

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Anti-phospho-girdin AntibodiesTuft CellsMouse JejunumCryosectionsParasite InfectionGastroenterologyHistological AnalysisIntestinal ContentsFormalin FixationGelatin EmbeddingCryosectioning

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Mizutani, Y., Kuga, D., Iida, M., Ushida, K., Takagi, T., Tokita, Y., Takahashi, M., Asai, M. Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections. J. Vis. Exp. (133), e57475, doi:10.3791/57475 (2018).
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