Summary

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Published: March 20, 2018
doi:

Summary

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Abstract

Die DNA-Schäden als Reaktion (DDR) verwendet eine Vielzahl von Proteinen zu erkennen, zu signalisieren und DNA-Läsionen zu reparieren. Abgrenzung dieser Reaktion ist entscheidend für die Genom-Wartung-Mechanismen zu verstehen. Da Rekrutierung und Austausch von Proteinen bei Läsionen sehr dynamisch sind, erfordert ihre Studie die Fähigkeit, DNA-Schäden schnell und räumlich abgegrenzt zu generieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur DNA-Schäden in den menschlichen Zellen mit einem handelsüblichen Laserscanning-konfokale-Mikroskop verfügt über eine 405 nm Laserlinie lokal zu induzieren. Ansammlung von Genom-Wartung, die Faktoren bei Laser Streifen durch Immunfluoreszenz (IF) oder in Echtzeit bewertet werden können mittels Proteine mit fluoreszierenden Reporter verschlagwortet. Verwendung von phosphorylierten Histon H2A. X (γ-H2A.X) und Replikation Protein A (RPA) als Marker, die Methode bietet ausreichenden Auflösung lokal rekrutiert Faktoren von denen zu unterscheiden, die auf angrenzenden Chromatin verteilt. Wir bieten weitere ImageJ-basierte Skripts effizient überwachen die Kinetik der Protein Relokalisierung DNA Websites beschädigen. Diese Verfeinerungen erleichtern erheblich die Studie der DDR Dynamik.

Introduction

Zellen sind ständig endogenen und exogenen Quellen von DNA-Schäden ausgesetzt, die ihre genomischen Unversehrtheit bedrohen. Die DDR ist ein Ensemble der Signalwege, die erkennen, zu signalisieren und zu reparieren DNA-Läsionen um Genomstabilität aufrecht zu erhalten. Im DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB), tritt die DDR hauptsächlich auf zwei komplementäre Plattformen: γ-H2A.X-mit der Bezeichnung Chromatin und einer resezierten einzelsträngiger DNA (SsDNA) Region in der Regel mit dem SsDNA-Bindung komplexe RPA1,2beschichtet.

UV-Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen, die bereits mit dem Thymidin analoge 5-Bromo-2′ Deoxyuridine (BrdU) oder der Bisbenzimide Ethoxide Trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA-Farbstoff sensibilisiert schafft eine Mischung aus einsträngiger Pausen (einschließlich DNA-Läsionen SSBs) und DSB, die eine lokalisierte DDR auf das Chromatin und SsDNA Plattformen3,4zu entlocken. Vorherigen Arbeiten zeigten, dass die Rekrutierung von Genom Wartungsfaktoren, diese zwei unterschiedlichen Plattformen auf DSB mit hochenergetischen UV-A-Lasern (335-365 nm) kombiniert mit IF2,5diskriminiert werden kann. Mikroskope mit solchen Lasern ausgestattet sind teuer, da sie ein Hochenergie-Laser und spezielle UV-A Übertragung Ziele damit weit weniger verbreitet in akademischen und pharmazeutischen Einstellungen als Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser erfordern Linien. Die Untersuchung von Protein-Rekrutierung und Austausch an Mikro-bestrahlten Standorten ist auch durch die mühsame manuelle Bildanalyse erforderlich, um das dynamische Verhalten des Genoms Wartungsfaktoren beschreiben ausgeschlossen.

Hier zeigen wir, dass die Pre-Sensibilisierung der Zellen mit BrdU oder BBET Nukleinsäure-Fleck gefolgt von Mikro-Bestrahlung mit einem 405 nm-Laser auf eine gemeinsame confocal Mikroskop ermöglicht die Überwachung des Genoms Wartung Faktor Dynamik bei DNA-Läsionen. Mit γ-H2A.X oder RPA komplexe Untereinheiten als Plattform Marker zusammen mit Z-Stapeln für größere Schärfentiefe und Dekonvolution für verbesserte Auflösung ermöglicht den Experimentator, Faktoren zu unterscheiden, die lokal zu DSB von denen geworben werden, die zu verbreiten großen Chromatin Domains rund um die ersten Läsion. Diese Untergliederungen nach unterschiedlichen Intra nuklearen Fächer hilft die möglichen Rollen des Fußgelenkes Proteine rekrutiert zu Mikro-bestrahlt Websites zu verfeinern. Wir bieten bequeme Protokolle und optimiert Rohrleitungen um die Dynamik des Genoms Wartungsfaktoren mit Open-Source-Software Fidschi (eine ImageJ-Verteilung)6,7,8schnell zu analysieren. Diese Verfeinerungen zu aktuellen Mikro-Bestrahlung Methoden ermöglichen die Studie der DDR in praktisch jedem Labor.

Protocol

1. Pre-Sensibilisierung der Zellen 24 h vor der Mikro-Bestrahlung Experiment seed 40.000 U2OS Zellen pro Bohrloch in 1 X DMEM mit 10 % FBS in 8-Well Kultur mit 170 µm dicken Deckglas-wie Glas/Kunststoff-Böden gleitet zu gewährleisten maximale Durchlässigkeit von 405 nm Laserlicht und exzellente Bildgebung mit einem Laser-scanning invertiert confocal Mikroskop. Wenn ein 8-Brunnen-Objektträger, verwenden Sie 500 µL Medien oder Lösungen pro Bohrloch für alle nachfolgenden Behandlungen und waschen Schritte …

Representative Results

Nach Mikro-Bestrahlung dürfen Zellen für einen bestimmten Zeitraum abhängig von der Art des Genoms Wartung Proteine1,12zu erholen. DSB werden bearbeitet von Nukleasen, weitgehend in den S und G2-Phasen des Zellzyklus, eine begrenzte Region SsDNA erstellen, die schnell von RPA und andere Genom Wartung Faktoren9beschichtet ist. SsDNA Region ist umgeben von Chromatin, die ausgiebig in der DDR, die Rekrutier…

Discussion

Verwenden die oben beschriebenen Methoden, ermöglicht 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen mit BBET oder BrdU bereits sensibilisiert die lokalisierte Erzeugung von DNA-Läsionen einschließlich der DSB in den Kernen der anhaftende menschliche Zellen. Kinetik der DDR bei diesen DSB ähneln denen generiert mit anderen Methoden in eukaryotischen Zellen9,18,19. DSB-Resektion an Mikro-bestrahlten Standorten führt zu SsDNA-Gene…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada [Discovery Grant 5026 bis Uhr] und eine nächste Generation von Wissenschaftlern Stipendium von der Cancer Research Society [21531 bis Uhr] unterstützt. Wir danken Jean-François Lucier bietet hervorragende Qualitätskontrolle der Fidschi-Python-Skripten und Ratschläge zur statistischen Analyse. Wir danken Dr. Stephanie A. Yazinski für IF Fixierung Lösung Rezept. Wir danken Paul-Ludovic Karsenti für Hilfe bei Lasermessungen macht.

Materials

Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, – phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

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Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

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