本研究は、子豚.の生体内で神経伝達物質の活動を監視する酵素法による微小電極アレイ (MEA) 技術の新しい使用法を探るそのグルタミン酸不全麻酔神経毒性のメカニズムに貢献しました。ここでは、麻酔神経毒性の機構解明のための MEA 技術を適応するためのプロトコルを提案する.
毎年、何百万もの子供たちのプロシージャの多数のための麻酔を受けます。ただし、両方の動物と人間の研究が麻酔薬として開発中の脳に潜在的に有毒の十三の子供の麻酔の安全性問題に呼び出されます。日には、研究が正常に解明しないカ所を麻酔によって神経があります。動物研究はそのようなメカニズムの調査を許可する、新生子豚が人間の脳に発達印象的な類似のためにこれらの効果を研究する優れたモデルを表します。
このプロトコルは適応麻酔神経毒性 (アイン) 機構を研究する新しい方法として酵素法による微小電極アレイ (MEA) 技術を使用します。測定は体内の神経伝達物質の活動のリアルタイム監視を有効にして例外的な時間・空間分解能を提供します。それは、麻酔薬の神経毒性はグルタミン酸の調節不全に原因の一部と MEAs グルタミン酸の測定方法を提供する仮定されます。ピグレット モデルにおける MEA 技術の新しい実装は、アインの研究のためのユニークな機会を提示します。
毎年、子供たちの何百万は米国1の侵襲的、非侵襲的な手順のための麻酔を受けます。長年、麻酔プロバイダーは小さな子供や新生児にも、麻酔薬の安全性の両親を安心させます。しかし、1999 年に、それは遷移を発見いた幼少時のグルタミン酸受容体の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) サブタイプの閉塞ラット2の広範な神経細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。最近、FDA は、麻酔と 3 歳以下のお子様の発展途上の脳に、潜在的な悪影響について警告を含むように麻酔薬のラベルを必要とする医薬品安全通信をリリース (米国食品と医薬品管理、2017)。しかし、まだ可能なメカニズムと神経保護方策を解明する必要があります。
Γ-アミノ酪酸 (GABA)、グルタミン酸などの神経伝達物質の正常な活動が発生する通常の神経発達に重要です。アインに関与する経路のほとんどがまだとらえどころのない、神経伝達物質システム、麻酔薬は、無意識を生成するこれらの経路を調節する知られているので関与する可能性が高い。特に、興奮性神経伝達物質グルタミン酸により応需型、その活性が調節不全。この神経伝達物質は、通常神経新生、神経可塑性、シナプス ・神経の成長、他の非常に重要な脳機能の数に関与しています。しかし、毒性とニューロンのアポトーシス、減らされたエネルギー可用性3酸素欠乏、手術などのストレス条件下で特にグルタミン酸受容体の長期にわたる活性化を引き起こす可能性が。NMDA グルタミン酸の結合受容体は、+の Na および Cl−流入を引き起こすこと示されています。その後脱分極は、Ca2 +チャネル開口につながると考えられているし、細胞内 Ca2 +のリリースは4を格納します。この機能不全の可能性がありますは、最終的に神経細胞増殖を減少、炎症を増加し、神経細胞死につながる代謝のかく乱の連鎖に します。これらの仮説にもかかわらずアインの該当カ所不明5のまま。、アポトーシスの役割のためグルタミン酸調節不全は、以前発表されたニューロンのアポトーシス、アインの機能のメカニズムに貢献するかもしれない経路を表します。
神経プロセスに関する障害の 1 つは神経の開発の設定で特にその高い複雑さです。人生の最初の数ヶ月は、ほとんど生理的なアポトーシス (神経剪定) などの神経の開発の重要なステップの時の怪我に最大の脆弱性の期間、シナプス形成、gliogenesis、髄鞘形成を取る場所6.神経回路の複雑な性質と正常な中枢神経系機能を中断することがなくこれらのプロセスを学ぶことの難しさを考えると、新しい技術が開発されて体内検出と重要な要素の定量化を目指して神経細胞のコミュニケーション。
MEA 技術の酵素は、本研究では臨床的に関連するピグレット モデルのアインのメカニズムを研究する新しい方法として使用されました。この技術は、グルタミン酸不全を含む電気化学脳プロセス複雑な生体内での研究に使用できます。Mea (2 グルタミン酸に敏感なサイトと 2 センチネル サイト) の組み込まれた 4 チャンネル プラチナ記録サイトこと自己参照が検出精度に貢献します。さらに、除外レイヤーは各電極に印加、授与されてから他の妨害分子を防止する選択検出7。さらに、MEA のロープロファイル設計は、以前のテクノロジと比較して最小限の組織外傷のためことができます。これと同じ機能は、MEAs の脳の微細な領域の研究を容易に高い空間分解能を与えます。たとえば、海馬 (海馬歯状回、CA1、CA2) の不連続な領域は特に勉強8をすることができます。測定の機能の詳細は、上記9をされています。
MEA 電気化学と比較してマイクロダイアリシスを組み込んだ関心の間に配置された膜と細胞外液の検出を許可すると同様の構成のソリューションを変更10。マイクロダイアリシス神経化学の主力である神経伝達物質の検出のため長い間使用されている、低時間分解能、グルタミン酸、および重要な組織外傷11発見が遅れの不利な点があります。
MEAs 直接検出できるない、コリン、アセチルコリン、グルタミン酸などの神経伝達物質など H2O2 O212,13 ゲルロボット レポーター分子を生成する適切なオキシダーゼ酵素を使用して.
MEA 技術は、アイン7,14以外の病態生理学的プロセスのコンテキストでの神経毒性の研究用ラットとヒト以外の霊長類で広く使用されています。これらの病態生理学的プロセスのいくつかの間で MEA 技術がアルツハイマー病、てんかん、外傷性脳損傷、およびシナプス通信8,15に及ぼす薬理学的化合物の研究のために使用されています,16,17. 測定は、ラットとヒト以外の霊長類でこれらの病態を研究に使用されている、人間と豚の脳の発達の高い類似性 MEA 技術の適応でなります子豚研究に非常に適した手法アイン言い18。
実験開始から、子豚の生理的恒常性この演習の事前文書21で説明されているように維持されなければなりません。パルス酸素濃度計、心電図やカプノグラフィー、非観血的血圧、温度監視を最小化を含めます。生理学的な摂動 (例えばハイポ/温熱療法、低酸素、低血圧、不整脈) を適切に修正できますので、訓練を受けた捜査が必要です。
誘導前に機能と知られている条件の下で MEA の選択性を確立する体外MEA 校正が実行されます。校正・測定のメッキ技術の活用が重要です。校正中に発生することができます多くの潜在的なエラーがあります。校正には、不適切な interferent 応答につながる不適切なめっきと同様に、これらの問題を特定できます。MEA の応答で発生するエラーの詳細表アカウントがコンパイルされている、に沿って顕著な原因と推奨される解決方法を証明する必要可能性があります (表 1) のトラブルシューティングに有用な機器です。MEA の機能と精度を記録に悪影響か、キャリブレーションとめっきする前にガラス電極を空気の泡や白い変色の有無を確認するかに注意することが重要です。
症状 | 原因 | 是正措置 |
信号がないです。 | 電極が接続されていません。 | 正しくパッチアンプ用アダプターと高速アンペロメトリー システムにパッチアンプ用アダプターに電極を接続します。 |
高速アンペロメトリー システムに電源が入らない | 高速システム背面の電源スイッチをオンに | |
信号ノイズ | 血液で汚染された電極 | 継続的に電極挿入時に脳の表面に水を引く |
DH2O で電極をすぐに洗い流してください。 | ||
酵素コーティングが緩んでいます。 | きれいにし、電極を再塗装 | |
参照電極の挿入または被覆されていません。 | コートし、頭皮の下遠く参照電極を配置 | |
電極は、脳の表面の動きを検出します。 | 表面的な構造で通常発生します。可能であれば電極より深い (一度に 1 mm) を挿入します。 | |
動物の動き | 動物が保護されていません。 | 頭蓋骨の後方でより安全な earbars に動物を移動します。良い体の配置のために胴体を昇格させます。 |
動物は麻酔不十分 | 麻酔器の整合性を確認します。実効線量と麻酔薬を滴定し、筋肉内のロクロニウム用量 (5 mg/kg) を管理 | |
不正確な電極配置 | 電極の配置が正しくないです。 | ヘッドへの適切な接続を維持しながら電極を調整してください。 |
定位座標は正確ではありません。 | 別の基準点または平面配置の参照されている子豚アトラスを使用しないことを確認します。 | |
頭蓋骨の得点で縫合マークを不明瞭にしない注意します。 |
表 1: 子豚の MEA のトラブルシューティングの手順を使用します。考えられる原因と是正措置の最適化とトラブルシューティングを支援します。
子豚用脳定位固定装置アトラスは、前18など不明点に関して関心のある領域の脳定位固定装置の座標を決定する使用されます。頭蓋骨がレベルと完全に固定されたことを確認する耳バーを適切に保護する必要があります。注意は、頭蓋骨の縫合線の可視化に影響を与える可能性がありますこの得点を避けるために頭皮の正中切開中にすべき。開窓は MEA を収容するのに十分な大きさでする必要があります。
このプロトコルは、品揃え豊富な手術室と治験責任医師/チーム プロトコルの手術と麻酔の面で熟練を必要とする技術的課題の数を示します。ピグレット モデルが齧歯動物のモデルよりもより高価なモデルがまた財政上の制限を示しますしかし、数千ドルを要することができるヒト以外の霊長類の使用よりもかなり安価です。MEA 技術の使用は、塗装の手順として独自の課題を提示し、熟練した調査官または十分な選択性と信頼性の高い機能を確保するためのアシスタントを必要とする手動で電極をめっきします。電極自身は、セラミック、こうして簡単に適切な注意を見られない場合を破損して、壊れやすい。電極は予告記録サイトを見えなくことができます手術の部位で血液からの録音でノイズを作成することができます、他の電気機器からの干渉があります。特殊な装置の必要性は、定位手術フレームはカスタム注入中にピグレット頭蓋骨を固定するように構築する必要がありますように追加負担を提示します。脳定位固定装置フレーム、グルタミン酸オキシダーゼ、電極自体はすべて高価です。さらに、最後の十年の内子豚定位アトラスの欠如子豚脳内の深部構造の特定の場所を決定する特定の専門知識を必要とする技術的な制限が生じます。おそらく核磁気共鳴を用いた新しい脳定位固定装置アトラスの開発は非常に豚でこの技術を使用する機能を高めます。
子豚は主に本種と人間の新生児との間に存在する類似点のための窒化アルミニウムの研究の臨床的に関連するモデルと同様の脳の構造と開発の双方します。マウスやラットなど一般的に使用されるモデルとは異なり子豚類似がある大きい中枢神経系、人間モデルの結果の訳しに貸す。ピグレット モデルはさらに安価であり、ヒト以外の霊長類モデルよりもそれほど複雑な処理が含まれます。ピグレット モデル プロセスを調べるものではのどの麻酔が発達神経毒性を誘発する神経学的損傷への貢献を測定、交絡因子による被害の問題に対処します。例えば、低酸素血症は、脳に対する世界的な効果があり、麻酔薬によって生じた損害について誤解されること。子豚は、結果の再現性を確保するため人間の薬で使用されるものと同じ手術と麻酔の条件で利用されています。
MEA 技術のセラミック ベースの使用はマイクロダイアリシスの現代の技術に関連付けられている欠点のいくつかを排除します。継続的に複数のグルタミン酸イベントを記録することができます MEA など電流測定方法と比較して時間的・空間的解像度が限られているマイクロダイアリシス最大 10 Hz23微視的領域。この急速なサンプリング レートは、ローカライズされた神経伝達物質拡散はマイクロダイアリシス24のような遅いサンプリング メソッドに固有の交絡因子を排除します。また、MEA は、挿入時に重要な神経膠症を引き起こすことができますと挿入サイト22で神経伝達物質の活動を変える可能性がありますマイクロダイアリシス プローブより低侵襲の方法です。
哺乳類モデル、測定技術、および脳の領域の範囲を利用した先行研究は、グルタミン酸の基底レベルに匹敵するこの手法を使用してを実証しています。MEA 技術、ピグレット モデルに適合した生体内でグルタミン酸濃度 (表 2) の有効な録音を提供することが示唆されました。
著者 (年) | 記録技術 | 動物モデル | 年齢 | 脳の地域 | 平均基底グルタミン酸濃度 (μ M) |
Hascup et al. (2008)23 | MEA (酵素ベース) | 齧歯動物 | 20-24 週 | 前頭前皮質、線条体 | 3.3 ± 1.0;5.0 ± 1.2 |
Hascup et al. (2010)25 | MEA (酵素ベース) | 齧歯動物 | 3-6 ヶ月 | 海馬 | 4.7 10.4 |
ラザフォード et al. (2007)9 | MEA (酵素ベース) | 齧歯動物 | 3-6 ヶ月 | 前頭前皮質、線条体 | 44.9 ± 4.7;7.3 ± 0.9 |
ミーレ et al. (1996)26 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 齧歯動物 | – | 線条体 | 3.6 ± 0.5 |
27日 et al. (2006) | MEA (酵素ベース) | 齧歯動物 | 3-6 ヶ月 | 前頭皮質、線条体 | 1.6 ± 0.3; 1.4 ± 0.2 |
キンテロ et al. (2007)28 | MEA (酵素ベース) | 非ひと霊長類 | 5.3 5.5 年 | 前野、大脳皮質運動野 | 3.8 ± 1.7;3.7 ± 0.9 |
スティーブンスら。 (2010 年)29 | MEA [スペンサー ・ ゲルハルト-2 (SG-2)] | 非ひと霊長類 | 11-21 歳 | 被殻 | 8.53 |
児玉 et al. (2002)30 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 非ひと霊長類 | – | 前頭前野 | 1.29 2.21 |
ガルバン et al. (2003)31 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 非ひと霊長類 | 少年 | 線条体 | 28.74 ± 2.73 |
間に、スペンサー (1993)32 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 人間 | 18-35 歳 | 海馬 | 20.3 ± 6.6 |
Reinstrup et al. (2000)33 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 人間 | – | 前頭皮質 | 16 ± 16 |
Cavus et al. (2005)34 | マイクロダイアリシス (酵素ベース) | 人間 | 15-52 年 | 大脳新皮質 | 2.6 ± 0.3 |
表 2。基底細胞外グルタミン酸 levelsacross の比較様々 な動物モデル。マイクロダイアリシスや電極を使用して健康な目を覚まし、麻酔下の動物に通常細胞外グルタミン酸レベルを確立する研究の選択したレビュー。
ピグレット神経学的転帰後麻酔の今後の評価 MEA ピグレット モデルで生体内でグルタミン酸濃度を監視する技術の使用を許可できます。生存実験が計画されている、これがヒトの新生児の神経認知もてなしが麻酔の長期的な影響の理解を深めます。生存実験行動テストとグルタミン酸の監視を可能にする麻酔暴露後長期間変更します。また、外科的介入の形で生理学的ストレスを発生する可能性が条件で麻酔を受ける子供のため一般的です。神経毒性の神経学的損傷と増加の観点から手術の影響に対処する未来研究子供の一般的な臨床設定のモデリングより正確ななります。慢性的な注入、私たち神経毒性に関連する行動の変更を追跡することができますを介してこれらの様々 なモデルの研究は、代替動物モデルの使用可能、です。今後の研究はグルタミン酸レベルの解析に限定する必要はありませんので、MEA 技術自体は、汎用性 (例えばGABA、コリン、リジンなど分析できる)。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、電極技術 (CenMeT) のためのケンタッキー大学センターと、オハイオ州立大学研究所動物リソース センター (ULAR) の貢献を認めると思います。
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